• Esx
• M. tuberculosis
• PE
• PPE

Le proteine secrete nel mezzo di coltura da Mycobacterium tuberculosis sono da tempo oggetto di intensi studi, sia per le loro proprietà immunogeniche che per il loro potenziale ruolo come fattori di virulenza (Andersen, 1997). Tra di esse, quelle appartenenti alle famiglie Esx, PE e PPE hanno suscitato particolare interesse negli ultimi anni in quanto è emerso che esse rappresentano antigeni immunodominanti peculiari dei micobatteri ed, in alcuni casi, fattori di virulenza del bacillo tubercolare importanti nell’interazione del microrganismo con l’ospite. Le proteine Esx sono secrete ad opera di specifici apparati di secrezione anch’essi peculiari dei micobatteri, denominati sistemi di secrezione ESX (ESX-1-ESX-5) (Gey van Pittius et al., 2006; Brodin et al., 2006). Ad oggi, tra tutti i sistemi ESX, è stato caratterizzato soltanto il sistema ESX-1, per il quale è stato dimostrato un ruolo importante nella virulenza di M. tuberculosis (Pym et al., 2002; Stanley et al., 2003; MacGurn et al., 2005; Brodin et al., 2006; Simeone et al., 2009). Il sistema ESX-5 è stato caratterizzato solo in M. marinum, un microrganismo non patogeno per l’uomo, che possiede un sistema ESX-5 omologo a quello di M. tuberculosis (Abdallah et al., 2006). In M. marinum, è stato osservato che tale sistema è coinvolto nella virulenza e nel trasporto in ambiente extracellulare di proteine PE/PPE. (Abdallah et al., 2006; Abdallah et al., 2008; Abdallah et al., 2009).
Oggetto del presente lavoro di tesi è stata la caratterizzazione del sistema di secrezione ESX-5 di M. tuberculosis, con particolare riguardo all’identificazione delle proteine che compongono l’apparato di secrezione ed allo studio del ruolo di tale sistema nella secrezione di proteine PE/PPE e nella virulenza del bacillo tubercolare.
La prima parte del lavoro sperimentale è stata finalizzata all’allestimento di cinque ceppi mutanti di M. tuberculosis H37Rv caratterizzati, rispettivamente, dall’inattivazione dei geni: i) rv1794, eccD5 ed eccA5, codificanti per tre differenti putativi componenti strutturali dell’apparato di secrezione; ii) ppe25-pe19, codificanti per le proteine PPE e PE associate al sistema ESX-5; iii) esxM, codificante per l’omonima proteina appartenente alla famiglia Esx., anch’essa codificata all’interno di ESX-5. Benchè sia stato anche tentato di ottenere dei ceppi mutanti per i geni eccB5, eccCa5 ed eccCb5, codificanti per altre tre putative componenti del sistema di secrezione ESX-5, tali tentativi non hanno dato esito positivo. La delezione di questi ultimi tre geni è stata possibile solo in un ceppo ricombinante di M. tuberculosis, contenente una copia funzionale di ciascuno dei tre geni integrata nel genoma, suggerendo che le proteine da essi codificate siano essenziali per la crescita in vitro di M. tuberculosis.
L’analisi della secrezione di EsxN (principale substrato del sistema ESX-5) da parte dei ceppi mutanti ha dimostrato che le proteine EccD5 ed EccA5 codificano, effettivamente, per componenti dell’apparato di secrezione ESX-5, in quanto la loro mutazione determina l’inattivazione del sistema ed abolisce la secrezione di EsxN. Al contrario, la distruzione del gene rv1794 non ha effetto sulla secrezione di EsxN, suggerendo che, a differenza di quanto riportato per M. marinum (Abdallah et al., 2009), la proteina da esso codificata non costituisce un componente del sistema di secrezione ESX-5 in M. tubrculosis. Infine, l’analisi della secrezione di EsxN, nel ceppo PPE25-PE19 ha evidenziato che anche le proteine PE/PPE associate al sistema ESX-5 sono coinvolte nella secrezione di EsxN.
L’analisi dei filtrati di coltura dei ceppi mutanti EccA5-ko ed EccD5-ko mediante elettroforesi bidimensionale ha dimostrato, inoltre, che il sistema ESX-5 è responsabile della secrezione non solo della proteina EsxN, ma anche di altre proteine Esx, appartenenti alla famiglia Mtb9.9 ed altamente omologhe ad EsxN (Alderson et al ., 2000).
Allo scopo di confermare precedenti osservazioni ottenute in M. marinum, è stato valutato l’effetto dell’inattivazione di alcune componenti del sistema ESX-5 sulla secrezione/localizzazione di proteine PE/PPE. I risultati ottenuti hanno indicato che la distruzione di singoli geni del sistema di secrezione ESX-5 di M. tuberculosis, non altera la localizzazione di proteine PE/PPE suggerendo che, a differenza di quanto descritto in M. marinum (Abdallah et al., 2006; Abdallah et al., 2009), l’inattivazione del sistema ESX-5 in M. tuberculosis non è sufficiente per alterare il trasporto e la localizzazione di tali proteine.
La seconda parte del lavoro di tesi è stata finalizzata allo studio dell’effetto dell’inattivazione di varie componenti del sistema ESX-5 sulla virulenza di M. tuberculosis. La crescita dei ceppi mutanti è stata confrontata con quella del ceppo parentale in diverse condizioni sperimentali: in vitro (in terreno liquido e solido), ex vivo (in linee cellulari di macrofagi e di pneumociti dell’uomo) ed in vivo (nel modello murino di infezione). Nessuna differenza è stata osservata tra i ceppi mutanti, rispetto al ceppo parentale, nella cinetica di crescita in terreno liquido. Al contrario, i ceppi EccD5-ko ed EccA5-ko hanno mostrato una ridotta capacità di crescita su terreno solido rispetto al ceppo parentale, suggerendo che l’inattivazione di alcune componenti del sistema ESX-5 possa determinare una riduzione della permeabilità della parete cellulare ai nutrienti.
Il confronto della crescita dei ceppi mutanti EccA5-ko, PPE25-PE19 ed EsxM-ko con quella del ceppo partenale in linee macrofagiche (THP-1) ed epiteliali polmonari (A549) dell’uomo ha evidenziato che le componenti EccA5, PPE25-PE19 ed EsxM hanno un ruolo nella crescita intracellulare di M. tuberculosis. L’analisi della virulenza dei tali ceppi in topi SCID ha dimostrato, infine, che la delezione dei geni codificanti per le proteine PE e PPE associate al sistema ESX-5 determina una marcata attenuazione nella capacità di crescita del ceppo corrispondente nel modello murino, valutata sia come riduzione del numero di CFU nella milza e nel polmone, che come riduzione dei livelli di splenomegalia, rispetto al ceppo parentale. Tali risultati indicano che le proteine PE e PPE associate al sistema ESX-5 rappresentano importanti fattori di virulenza di M. tuberculosis.
Nel loro insieme i risultati ottenuti nella presente tesi hanno permesso di chiarire alcuni aspetti riguardanti i meccanismi coinvolti nella secrezione, da parte del sistema ESX-5, di alcune proteine altamente immunodominanti del bacillo tubercolare, appartenenti alla famiglia Esx. Tali risultati hanno, inoltre, dimostrato che il sistema ESX-5 ed in particolare le proteine PE/PPE ad esso associate hanno un ruolo determinante nella virulenza di M. tuberculosis.