ETD

• cardiovascular risk
• chronic obstructive pulmonary disease
• extracellular vesicles
• thromboinflammation

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is associated with both local and systemic inflammation. Severe acute exacerbations of COPD (AE-COPD, defined as acute worsening in respiratory symptoms, beyond the usual day-by-day variability and requiring hospital admission) are associated with an excess of cardiovascular morbidity and mortality. It is conceivable that systemic inflammation is involved in this increased risk. Moreover, it is well known that inflammation and coagulation are closely related. The detrimental interplay between coagulation and inflammation is now referred to as thromboinflammation. Interestingly, many of the major cardiovascular events (myocardial infarction, stroke, pulmonary embolism) associated with severe AE-COPD recognize underlying thromboinflammatory mechanisms. Extracellular vesicles (EV) are small membranous vesicles, released by all human cells, both constitutively and upon specific stimuli, including inflammation, and are involved in intercellular communication. Moreover, EV seem to represent ideal players in promoting blood coagulation and thrombosis, since they can expose on their outer surface tissue factor (TF), the physiological initiator of coagulation in vivo. Even though there are some data about thromboinflammatory mechanisms in COPD, no studies have so far focused on EV.
The aim of this PhD project is therefore to investigate the potential thromboinflammatory effects of circulating EV from COPD patients. The research questions are the following: 1) can circulating EV exert a significant pro-thrombotic activity in COPD patients? 2) May EV represent pro-inflammatory effectors of the disease, through the stimulation of specific cell targets?
EV-associated TF concentration (EV-TF), measured through a one-stage clotting assay in which TF availability represents the limiting factor for the reaction, was used to evaluate plama-derived EV pro-thrombotic activity. To investigate EV-associated pro-inflammatory activity, EV were incubated with the bronchial cell line 16HBE and the EV-induced production of interleukin-8 (IL-8) and C-C motive chemokine ligand-2 (CCL-2). We enrolled 3 groups of subjects: 1) patients with severe AE-COPD, evaluated twice: at hospital admission (V0) and 8 weeks later (V1); 2) patients with stable COPD (sCOPD, no exacerbations in the last 12 months); 3) control subjects without COPD.
The final population included 93 subjects (30 AE-COPD, 50 sCOPD and 13 controls). In AE-COPD we found significantly higher EV-TF concentration at V0 than at V1. Moreover, EV-TF still remains higher at both V0 and V1 in AE-COPD than in sCOPD and in controls. We found the same statistically significant results for IL-8 and CCL-2, whose levels were higher at V0 than at V1, and higher in AE-COPD than in sCOPD and in controls. Last, we conducted a follow-up study in a subgroup of COPD patients (14 AE-COPD and 21 sCOPD), who were re-evaluated at 6 months. We found that EV-TF, IL-8 and CCL-2 all remained significantly higher in AE-COPD than in sCOPD at 6 months.
Taken together, these results confirm that EV can be involved in the thromboinflammatory events that are associated with AE-COPD and that could be responsible for the augmented, long lasting cardiovascular risk which characterizes severe AE-COPD.

La broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO, o COPD in inglese: chronic obstructive pulmonary disease) è associata a infiammazione locale e sistemica. Le riacutizzazioni gravi di BPCO (AE-COPD, definite come un peggioramento acuto dei sintomi respiratori che va oltre la normale variabilità quotidiana e tale da richiedere il ricovero ospedaliero) sono associate a un eccesso di morbilità e mortalità cardiovascolare. È plausibile che l’infiammazione sistemica sia coinvolta in questo aumento del rischio. Inoltre, è ben noto che infiammazione e coagulazione sono strettamente correlate. L’interazione dannosa tra coagulazione e infiammazione è oggi definita tromboinfiammazione. È interessante notare che molti dei principali eventi cardiovascolari (infarto miocardico, ictus, embolia polmonare) associati alle gravi AE-COPD riconoscono verosimilmente dei meccanismi tromboinfiammatori sottostanti. Le vescicole extracellulari (EV) sono piccole vescicole membranose rilasciate da tutte le cellule umane, sia in modo costitutivo sia in risposta a specifici stimoli, inclusa l’infiammazione, e sono coinvolte nella comunicazione intercellulare. Inoltre, le EV sembrano rappresentare attori ideali nel promuovere la coagulazione del sangue e la trombosi, poiché possono esporre sulla loro superficie esterna il fattore tissutale (TF), l’iniziatore fisiologico della coagulazione in vivo. Sebbene esistano alcuni dati sui meccanismi tromboinfiammatori nella BPCO, finora nessuno studio si è concentrato sulle EV.
L’obiettivo di questo progetto di dottorato è quindi investigare i potenziali effetti tromboinfiammatori delle EV circolanti nei pazienti con BPCO. Le domande di ricerca sono le seguenti:
1. Le EV circolanti possono esercitare un’attività protrombotica significativa nei pazienti con BPCO?
2. Le EV possono rappresentare effettori pro-infiammatori della malattia, attraverso la stimolazione di specifici bersagli cellulari?
La concentrazione di TF associato alle EV (EV-TF), misurata mediante un test di coagulazione a singolo stadio in cui la disponibilità di TF rappresenta il fattore limitante della reazione, è stata utilizzata per valutare l’attività protrombotica delle EV derivate dal plasma. Per studiare l’attività pro-infiammatoria associata alle EV, queste sono state incubate con la linea cellulare bronchiale 16HBE e si è valutata la produzione indotta di interleuchina-8 (IL-8) e ligando-2 della chemochina con motivo C-C (C-C motive chemokine ligand-2, CCL-2).
Sono stati arruolati tre gruppi di soggetti:
1. pazienti con AE-COPD grave, valutati due volte: al momento del ricovero ospedaliero (V0) e otto settimane dopo (V1);
2. pazienti con BPCO stabile (sCOPD, senza riacutizzazioni negli ultimi 12 mesi);
3. soggetti di controllo senza BPCO.
La popolazione finale comprendeva 93 soggetti (30 AE-COPD, 50 sCOPD e 13 controlli). Nei pazienti con AE-COPD abbiamo riscontrato una concentrazione di EV-TF significativamente più elevata a V0 rispetto a V1. Inoltre, i livelli di EV-TF rimanevano più alti sia a V0 sia a V1 nei pazienti con AE-COPD rispetto ai pazienti con sCOPD e ai controlli. Abbiamo ottenuto risultati statisticamente significativi analoghi per IL-8 e CCL-2, i cui livelli erano più elevati a V0 rispetto a V1 e più alti nei pazienti con AE-COPD rispetto a quelli con sCOPD e ai controlli.
Infine, è stato condotto uno studio di follow-up in un sottogruppo di pazienti con BPCO (14 AE-COPD e 21 sCOPD), rivalutati a 6 mesi. È emerso che EV-TF, IL-8 e CCL-2 rimanevano significativamente più elevati nei pazienti con AE-COPD rispetto ai pazienti con sCOPD anche dopo 6 mesi.
Nel complesso, questi risultati confermano che le EV possono essere coinvolte negli eventi tromboinfiammatori associati alle AE-COPD e che potrebbero essere responsabili dell’aumentato e prolungato rischio cardiovascolare che caratterizza le gravi riacutizzazioni di BPCO.