• Asincronismo
• metilazione
• retinoblastoma

La fase di replicazione del DNA può costituire un importante punto di controllo dell’espressione genica in quanto loci trascrizionalmente attivi sono generalmente replicati precocemente nella fase S mentre quelli inattivi sono replicati tardivamente. Anche loci ad espressione tessuto specifica mostrano un pattern replicativo coerente con questo modello. Normalmente i due alleli di un determinato locus sono replicati in maniera sincrona ma, fanno eccezione a questa regola geni soggetti ad imprinting ed i loci del cromosoma X nelle femmine dei mammiferi, in cui l’allele silenziato è replicato tardivamente. Recentemente è stato osservato un asincronismo in cellule leucemiche o in linfomi, anche per geni coinvolti nel processo di cancerogenesi come TP53, C-MYC ed RB1. La replicazione allele specifica se, com’è ipotizzato, riflette un’espressione allele-specifica, può rispecchiare un’alterazione epigenetica che si traduce in un’emizigosi funzionale del gene. Questo meccanismo, diverso dalla classica mutazione genetica, può costituire uno dei processi attraverso i quali una cellula acquisisce la quantità di mutazioni utili a trasformarla in cellula tumorale.
RB1 mappa in 13q14.2 e codifica per una nucleoproteina fosforilabile che controlla il ciclo cellulare e l’apoptosi. Perdita di funzione di tale gene è stata descritta sia nel retinoblastoma che in numerosi altri tipi di tumore. Uno dei meccanismi d’inattivazione genica è l’ipermetilazione nella regione del promotore del gene. Si ritiene che la perdita di funzione di RB1 possa essere un evento rilevante anche nello sviluppo di tumori tiroidei.
In questa tesi è valutato il pattern replicativo del gene per la suscettibilità al retinoblastoma RB1 in tumori tiroidei: adenomi e carcinomi papillari. Gli stessi soggetti sono stati utilizzati per una valutazione immunoistochimica dello stato di espressione della proteina. Dato il possibile coinvolgimento di fenomeni epigenetici nella regolazione dell’espressione di questo gene è stata effettuata una analisi dello stato di metilazione del promotore.
La tecnica utilizzata per l’analisi del tempo di replicazione è l’ibridazione fluorescente in situ (FISH) effettuata utilizzando una sonda locus specifica marcata con fluorocromo (vysis LSI 13/RB1). Lo stato replicativo del locus in analisi è dedotto dal tipo di segnale ottenuto: prima della replicazione l’ibridazione di ciascun cromosoma appare come segnale singolo e quindi la cellula presenta due segnali singoli, uno per ognuno dei due alleli. Dopo la replicazione del gene, l’ibridazione su ciascun cromosoma produce due segnali duplicati. Alleli che replicano in modo asincrono mostrano, almeno durante un periodo della fase S, un segnale singolo ed uno doppio. La FISH è stata effettuata su vetrini d’archivio conservati a -80°C ottenuti per apposizione o striscio di tessuti tumorali e sani, prelevati in sede chirurgica. Il tessuto normale, utilizzato per valutare il livello basale d’asincronismo nel tessuto non neoplastico, è stato prelevato quando possibile dal lobo sano della ghiandola, altrimenti da tessuto sano, ma non tiroideo dello stesso paziente. La particolare modalità d’allestimento dei preparati ha richiesto modificazioni alle normali procedure della tecnica FISH; in particolare i vetrini, dopo scongelamento, sono stati sottoposti a trattamento con RNasi e digestione con pepsina per permettere di liberare il nucleo da altre strutture cellulari che possono impedire il raggiungimento del materiale genetico da parte della sonda. Sono stati analizzati i tessuti di 13 soggetti; i preparati di ciascun individuo sono stati ibridati contemporaneamente; i valori d’asincronismo sono stati determinati analizzando nuclei interfasici su vetrini codificati mediante microscopio a fluorescenza. I dati ottenuti mostrano che la frequenza d’asincronismo replicativo nel tessuto tumorale è in media significativamente più alta (21% d. st. 3,7 p=0,000) di quella riscontrata nel tessuto normale (11,5% d. st. 4,4); i carcinomi papillari (22,1% d.st. 2,7) hanno valori di asincronismo maggiori degli adenomi (19,5% d. st. 4,7). Ciò può indicare che nelle cellule tumorali siano presenti modificazioni epigenetiche al locus RB1, probabilmetne associate ad un cambiamento nello stato di espressione del gene. La rilevanza di una alterazione della funzione del gene RB1 nei tumori tiroidei sembrerebbe indicata anche dalla presenza nei tumori analizzati di casi con un numero anomalo di segnali; in particolare in due individui il tumore è risultato caratterizzato da numerose cellule con un solo segnale, in altri due individui il tumore ha presentato invece una frequenza elevata di cellule con 3 o 4 segnali. Per comprendere se queste anomalie fossero dovute a delezioni o duplicazioni del locus o a mutazioni numeriche del cromosoma 13, è stata effettuata una doppia ibridazione, utilizzando contemporaneamente alla sonda per RB1 una sonda specifica per la regione telomerica del cromosoma 13 (Oncor: tel 13q). L’analisi combinata di queste nei singoli nuclei ha evidenziato la sola presenza di aneuploidie: nel tessuto tumorale dei soggetti con un singolo segnale sono presenti cellule con perdita di uno dei due cromosomi 13; nei soggetti con più segnali sono presenti copie sovrannumerarie del cromosoma.
La replicazione tardiva di un allele di RB1, osservata in numerose cellule tumorali, può essere associata ad un’espressione monoallelica. Sono stati valutati pertanto i livelli di espressione della proteina tramite analisi immunoistochimica, effettuata su tessuti tumorali conservati in paraffina di un campione costituito da 10 dei 13 soggetti utilizzati per l’analisi dell’asincronismo replicativo. Come controllo è stata valutata l’espressioen nel tessuto sano peritumorale. Questa analisi ha messo in evidenza una possibile implicazione della perdita di funzione del gene RB1 nello sviluppo dei tumori tiroidei in quanto i tessuti normali e gli adenomi esprimono la proteina ad alti livelli, mentre nei tumori maligni si ha una completa perdita di espressione. Dato il possibile coinvolgimento di mutazioni epigenetiche nell’silenziamento di questo gene, abbiamo valutato la presenza di una inattivazione funzionale di RB1 nei tumori analizzati, verificando lo stato di metilazione del promotore. Tra le varie tecniche che permettono di valutare lo stato di metilazione di una piccola regione del DNA è stata considerata come ottimale la tecnica della modificazione con bisolfito che permette di evidenziare anche limitate quantità di DNA metilato. La tecnica è stata messa a punto nel nostro laboratorio, utilizzando standard di reazioni rappresentati da DNA ottenuto da cellule normali e tumorali; come controllo della specificità della metodica applicata è stato utilizzato del DNA commerciale che presenta metilazione di tutti i dinucleotidi CG. Il metodo del trattamento con sodio bisolfito utilizza la capacità di questo di deaminare la citosina in uracile; dato che la metilazione protegge la citosina dalla modificazione non si ha modificazione in uracile nelle isole CpG di geni con promotore metilato. Per verificare la presenza di metilazione si effettua una PCR nested utilizzando primers per la regione scelta; 233 pb nel promotore di RB1 comprendenti 37 CpG che sono sito di legame per noti fattori di trascrizione. I primers sono stati appositamente disegnati per la sequenza modificata e sono capaci di amplificarla indipendentemente dallo stato di metilazione di quest'ultima. Il grado di metilazione è valutato dopo il sequenziamento della regione amplificata determinando la frazione di citosine e timine. Il metodo è stato applicato su DNA estratto dai campioni di tessuto normale e tumorale degli individui utilizzati per le precendenti analisi, in modo da poter confrontare il grado di metilazione con i livelli di asincronismo e con lo stato di espressione della proteina. Le analisi hanno evidenziato l’assenza di metilazione nel promotore del gene RB1 sia nei tessuti sani che nei tessuti tumorali. Nessuna delle citosine analizzate è risultata metilata in questi tessuti.
Questi risultati mostrano come alti valori di asincronismo siano potenzialmente associabili a perdita di espressione del gene e che mutazioni epigenetiche come la metilazione del promotore non sembrano essere coinvolte in questi fenomeni. La perdita di espressione osservata esclusivamente nei tumori maligni sembra assegnare a questo gene un possibile ruolo nello sviluppo di questi tumori.