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Archivio digitale delle tesi discusse presso l’Università di Pisa

Tesi etd-02172025-123628


Tipo di tesi
Tesi di dottorato di ricerca
Autore
MILANO, CHIARA
URN
etd-02172025-123628
Titolo
Immune system and seizures: from autoimmune encephalitis to drug-resistant epilepsy
Settore scientifico disciplinare
MEDS-12/A - Neurologia
Corso di studi
SCIENZE CLINICHE E TRASLAZIONALI
Relatori
tutor Prof. Siciliano, Gabriele
correlatore Dott.ssa Pizzanelli, Chiara
tutor Dott.ssa Spatola, Marianna
Parole chiave
  • autoimmune encephalitis
  • crisi epilettiche e sistema immunitario
  • drug-resistant epilepsy
  • encefaliti autoimmuni
  • epilessia farmacoresistente
  • seizures and immune system
Data inizio appello
21/02/2025
Consultabilità
Non consultabile
Data di rilascio
21/02/2095
Riassunto
SUMMARY (English version)

Introduction: In recent years, there is a growing understanding that the immune system plays a role in ictogenesis and epileptogenesis, with different levels of evidence. On the one hand, there are the autoimmune encephalitides, that often manifest with acute symptomatic seizures, in which there is clear evidence that the adaptive immune system (and in particular antibodies against neuronal proteins) plays a pivotal pathogenic role. On the other hand, there are the chronic drug-resistant epilepsies, including mesial temporal lobe epilepsy (MTLE), in which there is some evidence that the innate immune system may play a role in epileptogenesis, although defining a causal relationship is more complex.
In this PhD project, I analysed the role of immune system in seizures development and persistence in two different clinical scenarios: autoimmune encephalitides manifesting with seizures among other symptoms and MTLE.

Hypotheses and aims: 1) Autoimmune encephalitides represent an excellent model to study how the adaptive immune system (i.e., autoantibodies) contributes to neuronal hyperexcitability and seizure development. I hypothesize that a deeper understanding of antibody-mediated pathogenic mechanisms is crucial not only for identifying new ictogenic pathways, but also for uncovering potential therapeutic targets. Therefore, I aimed to review the current knowledge about the pathogenic mechanisms of antibody-mediated autoimmune encephalitides, focusing on recent developments and future research directions, especially in the two most common types in adults, i.e., anti-leucine-rich glioma inactivated 1 protein (anti-LGI1) and anti- N-methyl-D-aspartate receptor (anti-NMDAR) encephalitis; 2) Seizures are common clinical manifestations of most autoimmune encephalitides, including anti-α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor (anti-AMPAR) and anti- γ-aminobutyric acid type A receptor (anti-GABAAR) encephalitis, but little is known about long-term outcome and the risk of chronic epilepsy in these diseases. I hypothesize that an increased knowledge on long-term neurological sequelae will improve clinical and therapeutical management of these patients, and will allow the identification of those who might benefit the most from aggressive immunotherapies and rehabilitation. I aimed to characterize the clinical features and define the prognostic factors and long-term outcome (including the risk of epilepsy) of anti-AMPAR and anti-GABAAR encephalitis in children and adults; 3) Accurate diagnosis and specific antibody identification are fundamental in the context of autoimmune encephalitis. Detection of these antibodies relies on cell-based and tissue-based techniques that have been established by reference centres/laboratories. However, many clinical laboratories worldwide lack the adequate facilities to perform these tests, and often rely on commercial diagnostic kits. I hypothesize that these commercial tests may not have the same sensitivity and specificity as standardized in-house techniques used in neuroimmunology referral centers, which might lead to higher rates of false positive and false negative results. Thus, I aimed to assess the diagnostic yield of commercial tests for the detection of neural antibodies (targeting both surface/synaptic and intracellular antigens); 4) Mesial temporal lobe epilepsy is the most common form of focal epilepsy in adults. Approximately one third of patients with this condition do not respond to antiseizure medications, a phenomenon known as drug-resistance. It has been hypothesized that drug-resistance can be sustained by mechanisms of neuroinflammation, and that innate immune cells in the epileptic focus can release inflammatory molecules, some of which enter the bloodstream. I hypothesize that the identification of peripheral inflammatory biomarkers will help to distinguish patients with drug-sensitive and drug-resistant forms of the disease. Therefore, I aimed to examine serum inflammatory biomarkers and cytokine expression in peripheral blood mononuclear cells in drug-resistant vs. drug-sensitive patients with mesial temporal lobe epilepsy.

Methods: Clinical information of included patients was obtained through structured questionnaires or by reviewing medical records. Antibodies targets were determined using rat brain immunohistochemistry, cell-based assays, and immunoblot. Analysis of serum inflammatory biomarkers was performed using a R&D Systems Luminex Assay, while the analysis of intracellular cytokines in monocytes and lymphocytes was performed using an eight-colour flow cytometer.

Results: 1) Autoantibodies against neural antigens may cause seizures by enhancing excitatory circuits, either through direct stimulation or by suppressing inhibitory mechanisms. For instance, in anti-LGI1 encephalitis, the autoantibodies are able to disrupt the physiological interactions between LGI1 and other membrane proteins. This disruption causes dysfunctions of presynaptic Kv1.1 channels and post-synaptic AMPAR, resulting in excessive glutamate release and consequent neuronal hyperexcitability; 2) Both anti-AMPAR and anti-GABAAR encephalitis often manifest with seizures during the acute phase, but the development of chronic epilepsy is extremely rare (less than 5%). In both diseases, a prompt immunotherapy administration, with escalation to second-line therapy in severe cases, is crucial to prevent long-term sequelae and to improve outcome. Younger patients have a better prognosis, experiencing less neurological sequelae at long-term follow-up (> 2 years). Moreover, in anti-AMPAR encephalitis, children have different clinical features during the acute phase and no tumor’s association compared to adults; in particular they have more frequent behavioral/psychiatric symptoms at onset (5/13, 39% vs. 8/71, 11%, p=0,026), more frequent cerebellar dysfunctions (6/13, 46% vs. 7/68, 10%, p=0,005) and movement disorders (5/13, 39% vs. 8/67, 12%, p=0,032) during the course of the disease, and extratemporal brain MRI lesions are more common compared to adults (4/9, 44% vs. 5/44, 11%, p=0,035). In patients with anti-AMPAR encephalitis, those with concomitant antibodies against intracellular targets have lower survival, suggesting additional pathogenic mechanisms in this subgroup of patients; 3) The diagnostic performance of commercial tissue-based assays is suboptimal, since they produce a significant percentage of false negative results (around 30% for autoantibodies against intracellular neural antigens; around 20% for autoantibodies against surface or synaptic antigens). Therefore, they should not be used as a screening test, as a false negative result may discourage further diagnostic tests, wrongly leading to rule out the diagnosis of antibody-associated encephalitis; 4) Patients with mesial temporal lobe epilepsy have increased amount of serum chemokines (i.e., CCL-2 and CCL-3) whose function is to chemoattract peripheral monocytes in inflamed sites. When analysing intracellular cytokines, monocytes from drug-resistant patients were able to produce higher levels of IL-1β and IL-6 compared to healthy controls and drug-sensitive patients, as if they were primed to produce inflammatory cytokines, which may contribute to perpetuate the inflammatory response also in the epileptic focus.

Conclusions: Results from these studies allowed me to 1) clarify the pathogenic mechanisms responsible for seizures and other neurological symptoms in antibody-associated encephalitides; 2) describe the clinical differences between children and adults with anti-AMPAR encephalitis, and evaluate the long-term outcome of patients with both anti-AMPAR and anti-GABAAR encephalitis; 3) demonstrate that commercial tests for the detection of neural antibodies produce high rate of false negative results and should thus not be used as screening tests; 4) provide evidence that in chronic epilepsies, such as mesial temporal lobe epilepsy, peripheral immune cells may play a role in perpetuating inflammatory responses, which in turn might promote ictogenesis and contribute to ongoing epileptic activity.



RIASSUNTO (Italian version)

Introduzione: Numerosi studi recenti hanno dimostrato, sebbene con diversi livelli di evidenza, un possibile ruolo del sistema immunitario nello sviluppo e nella persistenza di crisi epilettiche. Da un lato ci sono le encefaliti autoimmuni, che spesso si manifestano con crisi epilettiche sintomatiche acute, nelle quali vi è una chiara evidenza che il sistema immunitario adattativo (e, in particolare, gli anticorpi rivolti contro antigeni neuronali) giochi un importante ruolo patogenetico. Dall’altro lato vi sono le epilessie farmaco-resistenti, tra cui l’epilessia del lobo temporale mesiale, in cui il sistema immunitario innato sembra avere un ruolo nella persistenza delle crisi epilettiche, sebbene definire una relazione causale sia più complesso.
In questo progetto di dottorato ho analizzato il ruolo del sistema immunitario nello sviluppo e nella persistenza di crisi epilettiche in due scenari clinici differenti: le encefaliti autoimmuni e l’epilessia del lobo temporale mesiale.

Ipotesi e obiettivi: 1) Le encefaliti autoimmuni rappresentano un modello ideale per studiare come il sistema immunitario adattativo (i.e., gli autoanticorpi) contribuisca all’ipereccitabilità neuronale e allo sviluppo di crisi epilettiche. Ipotizzo che una comprensione più dettagliata dei meccanismi anticorpo-mediati sia cruciale non solo per identificare dei nuovi pathways ictogenici, ma anche e soprattutto per sviluppare nuovi potenziali target terapeutici. Pertanto, ho effettuato una review della letteratura con lo scopo di esaminare i meccanismi patogenetici di più recente scoperta, responsabili anche di crisi epilettiche, nelle encefaliti autoimmuni anticorpo-mediate, focalizzandomi sui due tipi più comuni nell’adulto, i.e., l’encefalite da anticorpi anti-leucine-rich glioma inactivated 1 protein (anti-LGI1) e l’encefalite da anticorpi anti- N-methyl-D-aspartate receptor (anti-NMDAR); 2) Le crisi epilettiche sono una manifestazione clinica comune a molte encefaliti autoimmuni, incluse l’encefalite da anticorpi anti-α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor (anti-AMPAR) e l’encefalite da anticorpi anti- γ-aminobutyric acid type A receptor (anti-GABAAR), ma tuttora rimangono poco conosciuti l’outcome a lungo termine e il rischio di sviluppare epilessia in queste patologie, una volta superata la fase acuta. Ipotizzo che ampliare la conoscenza riguardo le sequele neurologiche in questi pazienti consentirà l’identificazione di coloro che potranno beneficiare maggiormente di immunoterapie aggressive e protocolli di riabilitazione. Di conseguenza, ho analizzato le caratteristiche cliniche e definito i fattori prognostici e l’outcome a lungo termine (incluso il rischio di sviluppare epilessia) in bambini e adulti con encefalite da anticorpi anti-AMPAR e da anticorpi anti-GABAAR; 3) Nel contesto delle encefaliti autoimmuni è fondamentale l’identificazione dell’anticorpo responsabile ai fini di una diagnosi accurata. Nei laboratori di neuroimmunologia di riferimento, l’identificazione di questi anticorpi si basa su tecniche in-house, che comprendono tissue-based assays e cell-based assays/immunoblot. Purtroppo, molti laboratori clinici non hanno le strutture adeguate per realizzare questi test e, pertanto, analizzano i campioni tramite kits diagnostici commerciali. Ipotizzo che questi kit non abbiano la stessa sensibilità e specificità delle tecniche standardizzate utilizzate nei laboratori di riferimento, e che questo possa tradursi in una percentuale elevata di risultati falsi positivi o negativi. Pertanto, ho valutato per la prima volta la performance diagnostica dei kit commerciali utilizzati per identificare gli anticorpi implicati nelle encefaliti autoimmuni (sia con target intracellulare che con target di superficie o sinaptico); 4) L’epilessia del lobo temporale mesiale è la forma più comune di epilessia focale nell’adulto. Circa un terzo delle persone affette da questa patologia non rispondono ai farmaci anticrisi, un fenomeno noto come farmaco-resistenza. Recenti studi hanno ipotizzato che la farmaco-resistenza sia sostenuta da meccanismi di neuroinfiammazione e che le cellule del sistema immunitario innato, presenti nel focus epilettogeno, siano in grado di rilasciare molecole infiammatorie anche nel sangue di questi pazienti. Ipotizzo che l’identificazione di biomarcatori di infiammazione periferici possa essere utile per distinguere pazienti farmaco-resistenti da pazienti farmaco-sensibili. Pertanto, ho analizzato biomarcatori infiammatori sierici e intracellulari in pazienti con epilessia del lobo temporale mesiale distinti in farmaco-resistenti e farmaco-sensibili.

Metodi: Ho raccolto le informazioni cliniche dei pazienti inclusi attraverso le cartelle cliniche o tramite questionari appositi inviati ai rispettivi curanti. Ho determinato i target degli anticorpi utilizzando metodiche di immunoistochimica su fettine di cervello di ratto, cell-based assays e immunoblot. Ho effettuato l’analisi dei biomarcatori sierici di infiammazione tramite metodica R&D Systems Luminex Assay, mentre ho effettuato l’analisi delle citochine intracellulari in monociti e linfociti utilizzando un citofluorimetro ad otto canali.

Risultati: 1) Gli anticorpi rivolti contro antigeni di superficie o sinaptici del sistema nervoso centrale possono causare crisi potenziando i circuiti eccitatori, sia tramite stimolazione diretta che tramite soppressione di meccanismi inibitori. Per esempio, nell’encefalite da anticorpi anti-LGI1, gli autoanticorpi alterano le interazioni fisiologiche tra la proteina LGI1 e altre proteine della membrana neuronale. Queste alterazioni provocano disfunzioni nei canali del potassio Kv1.1 presinaptici e nei recettori AMPAR postsinaptici, provocando un eccessivo rilascio di glutammato e conseguente ipereccitabilità neuronale; 2) Sia l’encefalite da anticorpi anti-AMPAR che l’encefalite da anticorpi anti-GABAAR si manifestano spesso con crisi epilettiche durante la fase acuta, ma lo sviluppo di epilessia a lungo termine è estremamente raro (riguardando meno del 5% dei pazienti). In entrambe le patologie, la somministrazione rapida di immunoterapia, con escalation a terapia di seconda linea nei casi più severi, è cruciale per prevenire le sequele a lungo termine e migliorare l’outcome. I pazienti più giovani hanno una prognosi migliore, con meno sequele neurologiche al follow-up a lungo termine (più di 2 anni). Inoltre, nell’encefalite anti-AMPAR, i bambini hanno differenti manifestazioni cliniche rispetto agli adulti e non mostrano associazione con tumori; in particolare, i bambini hanno più frequentemente alterazioni comportamentali/psichiatriche all’esordio di malattia (5/13, 39% vs. 8/71, 11%, p=0,026), più frequenti disfunzioni cerebellari (6/13, 46% vs. 7/68, 10%, p=0,005) e disturbi del movimento (5/13, 39% vs. 8/67, 12%, p=0,032) durante il corso della malattia e più frequenti alterazioni extratemporali alla risonanza cerebrale (4/9, 44% vs. 5/44, 11%, p=0,035) rispetto agli adulti. Nei pazienti con encefalite anti-AMPAR, i pazienti con concomitanti anticorpi contro antigeni intracellulari hanno ridotta sopravvivenza; questo suggerisce che vi siano degli ulteriori meccanismi patogenetici in questo sottogruppo di pazienti; 3) La performance diagnostica dei tissue-based assays commerciali è subottimale, dato che producono una percentuale significativa di risultati falsi negativi (circa il 30% per gli anticorpi contro antigeni intracellulari, circa il 20% per gli anticorpi contro proteine di superficie o sinaptiche). Pertanto, questi kits non dovrebbero essere utilizzati come test di screening, dal momento che un risultato falso negativo porterebbe erroneamente ad escludere la diagnosi di encefalite autoimmune; 4) I pazienti con epilessia del lobo temporale mesiale hanno una quantità più elevata rispetto ai controlli sani di alcune chemochine sieriche (CCL-2 e CCL-3) la cui funzione è quella di chemioattrarre i monociti periferici in siti di infiammazione. A livello di citochine intracellulari, soltanto i monociti dei pazienti farmaco-resistenti sono in grado di produrre quantità più elevate di IL-1β e IL-6 rispetto ai controlli sani, come se fossero già predisposti alla produzione di citochine pro-infiammatorie, che potrebbero contribuire alla risposta infiammatoria nel focus epilettogeno.

Conclusioni: I risultati di questi studi mi hanno consentito di: 1) chiarire i meccanismi patogenetici responsabili delle crisi epilettiche e di altri sintomi neurologici nelle encefaliti autoimmuni; 2) descrivere le differenze cliniche tra bambini e adulti con encefalite da anticorpi anti-AMPAR e valutare l’outcome a lungo termine di pazienti sia con encefalite da anticorpi anti-AMPAR che con encefalite da anticorpi anti-GABAAR; 3) dimostrare che i test commerciali per l’identificazione di anticorpi implicati nelle encefaliti autoimmuni producono un’elevata percentuale di falsi negativi e non dovrebbero essere utilizzati come test di screening; 4) evidenziare che, nell’epilessia del lobo temporale mesiale, le cellule periferiche del sistema immunitario possono avere un ruolo nel perpetuare le risposte infiammatorie nel focus epilettogeno, le quali contribuiscono a loro volta all’attività epilettica.
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