• acanthamoeba
• ATP
• legionella
• resuscitation
• VBNC

Il controllo del rischio idrico nelle strutture sanitarie rappresenta una prerogativa importante per garantire la sicurezza dei pazienti e degli operatori. La monoclorammina è stata recentemente introdotta nella disinfezione delle acque calde sanitarie per il controllo del rischio microbiologico da waterborne pathoges. Il suo utilizzo è favorito dal fatto che, a differenza di altri disinfettanti a base di cloro quali ipoclorito e biossido di cloro, ha un'azione ossidante più lenta che consente una maggiore efficacia nei confronti del biofilm presente lungo la rete acquedottistica. La letteratura esistente evidenzia come sia possibile controllare la colonizzazione da Legionella spp. con l’uso di questo disinfettante, ma non è ancora stato dimostrato se questo corrisponde ad una eradicazione. Inoltre la presenza di monoclorammina sembra essere in grado di selezionare altre specie microbiche, favorite dalla ridotta concorrenza vitale, quali i nontuberculous mycobacteria (NTM), microrganismi capaci di sopravvivere e replicarsi come parassiti dei protozoi acquatici, all’interno dei quali resistono all’attività biocida dei disinfettanti utilizzati per la potabilizzazione delle acque. In questo studio sono stati analizzati vantaggi e svantaggi dell’uso della monoclorammina per la disinfezione dell'acqua calda sanitaria attraverso il monitoraggio della qualità dell’acqua erogata in un edificio di nuova costruzione all’interno di un ospedale di alta specializzazione.
A tal fine è stato programmato un piano di campionamenti lungo la rete di distribuzione dell’acqua calda sanitaria, in siti prossimali e distali dal generatore di monoclorammina, in modo da poter ricercare, mediante metodi colturali e molecolari, la presenza sia di Legionella spp. che di NTM, sia nell’acqua che nei biofilms formatisi nei corrispettivi siti di campionamento. La presenza di Legionella spp. è stata indagata secondo la norma ISO 11731-2:2004 mentre per la ricerca di NTM è stato utilizzato il protocollo proposto da Falkinham (Journal of Applied Microbiology 2009). L’identificazione è stata condotta tramite multilocus sequence typing per Legionella (Protocollo EWGLI) e PCR Restriction Analysis seguita da sequenziamento del gene hsp65 (Telenti 1992). Inoltre è stata eseguita l’analisi chimico-fisica delle acque per individuare fattori favorenti la colonizzazione microbica e la determinazione dei parametri microbiologici di potabilità dell’acqua. Al fine di ottenere un’analisi in tempo reale della presenza di Legionella spp., ne è stata determinata la quantità di ATP intracellulare, attraverso metodica di immuno-cattura e reazione di bioluminescenza, oltre alla determinazione in real-time PCR della quantità del gene mip specifico del batterio in esame. Queste metodiche consentono la rilevazione anche di “forme vitali non coltivabili” la cui presenza è stata indagata con uno studio mirato di resuscitation con co-coltura in Acanthamoebae polyphaga, Per la messa a punto del protocollo di infezione, sono state eseguite delle prove di co-coltura con L.p. Philadelphia a diverse MOI (molteplicità di infezione) dimostrando l’internalizzazione tramite microscopia elettronica. L’analisi in real-time PCR per la ricerca dei NTM ha previsto l’amplificazione del gene RNA 16S.
In circa 24 mesi di monitoraggio è stato possibile dimostrare l’efficacia del disinfettante nei confronti di Legionella spp., che in coltura non è stata mai rilevata in nessun campione analizzato, fatta eccezione per i mesi Maggio 2011 e Ottobre 2012, in cui, a causa di un blocco temporaneo della distribuzione di monoclorammina, lo stesso clone di Legionella è riapparso in tutti i siti in esame, con un valore medio di 83546 UFC/L. La multilocus sequence typing ha permesso di confermare la presenza del genotipo L.p. Wadsworth ST269, già isolato in precedenza, prima dell’inizio della disinfezione. I campioni risultati negativi con metodi colturali hanno tuttavia dato esito positivo in real-time PCR, con un valore medio di 2197 UG/L. Questi risultati sono stati confermati anche dalla determinazione del ATP intracellulare, infatti i campioni esaminati dopo la disinfezione con monoclorammina, pur non rilevando crescita in coltura, hanno mostrato valori di concentrazione di ATP ad di sopra del detection limit assunta pari al valore di 100 pg/L di ATP. Per dimostrare la presenza di forme vitali non coltivabili sugli stessi campioni sono state eseguite le prove di resuscitation, ma nessuna co-coltura ha dato esito positivo. L’analisi dei biofilms per la ricerca di legionella è risultata positiva nei mesi in cui non c'era monoclorammina in rete, ed inoltre in due campionamenti dove la Legionella non è stata ritrovata in acqua. Per quanto riguarda i NTM la ricerca effettuata con metodi colturali è risultata positiva in tutti i siti, con un valore medio di 1410 UFC/L. Il sequenziamento ha consentito di identificare tra i NTM il M. gordonae (86%); M.mucogenicum (7%); altri tipi di NTM(7%). Il 52% dei campioni è risultato positivo alla ricerca di NTM nel biofilm, in particolare nel sito più distale dal generatore di monoclorammina. Non sempre è stata vista una relazione tra NTM nell'acqua e nel biofilm, dal momento che, in alcuni siti, i NTM sono risultati positivi nel biofilm ma non nell'acqua.
In conclusione, dai risultati ottenuti si può desumere che il dosaggio di monoclorammina attualmente in uso nella struttura ospedaliera presa in esame (2,5 ppm) consente il controllo efficace di Legionella anche nella forma vitale non coltivabile. Alcuni autori hanno dimostrato che la monoclorammina ad una concentrazione superiore a 1 mg/L da un lato rende impossibile la resuscitation delle forme vitali non coltivabili di Legionella spp. e dall'altro lato sembra favorire la persistenza e l'incremento nel biofilm di NTM, in particolare di Mycobacterium mucogenicum. Pertanto, l'esito negativo ottenuto dalla “resuscitation” può dipendere dalla quantità di monoclorammina presente in acqua. Anche in questo studio è stata dimostrata la selezione di NTM e quindi è possibile affermare che una corretta valutazione dei rischi deve prendere in considerazione la comparsa di rischi emergenti, che devono essere valutati non solo con le metodiche tradizionali, ma anche attraverso tecniche alternative che possono meglio chiarire le modificazioni della popolazione microbica a seguito della disinfezione.