• methylation sensitive-high resolution melting

La malattia di Alzheimer (MA) è una malattia neurodegenerativa che rappresenta da sola circa i due terzi di tutte le forme di demenza; è caratterizzata clinicamente da un progressivo deterioramento delle funzioni cognitive e da atrofia cerebrale che si localizza prevalentemente a livello della neocorteccia. Circa il 5-10% dei casi della malattia è riconducibile a mutazioni causative a carico dei geni PSEN1, PSEN2 e APP; nella maggior parte dei casi (90-95%) invece ha un carattere sporadico e mostra una patogenesi complessa, verosimilmente dovuta all’interazione tra fattori di origine ambientale e fattori genetici di suscettibilità. La MA è caratterizzata dalla deposizione di beta-amiloide (Abeta) in forma di placche diffuse, dette amiloidi, e dall’alterazione della struttura citoscheletrica neuronale rappresentata dai grovigli neurofibrillari. Abeta è il prodotto del taglio proteolitico della proteina precursore dell’amiloide (APP), ad opera di beta-secretasi (BACE1) e γ-secretasi. Recentemente è emerso il ruolo dell’epigenetica (regolazione dei geni tramite processi chimici, come metilazione del DNA e acetilazione degli istoni, che non comportano cambiamenti nella sequenza del DNA, ma che possono modificare il fenotipo dell’individuo) nell’insorgenza di alcune malattie neurodegenerative; quindi, oltre ad alterazioni genetiche, diversi studi confermano il coinvolgimento di alterazioni epigenetiche sulla modulazione dell’espressione di geni correlati con la MA. E’ stata infatti rilevata un’anomala metilazione dei promotori di geni che partecipano al processamento della Abeta (PSEN1, APOE) e che sono coinvolti nella metilazione del DNA (MTHFR, DNMT1). Lo scopo di questo lavoro è quello di valutare i livelli di metilazione del promotore di BACE1 in una popolazione studio costituita da 20 individui affetti da MA, 20 soggetti con decadimento cognitivo lieve (Mild Cognitive Impairment o MCI), ovvero lo stadio di transizione tra l’invecchiamento normale e la demenza, e 20 controlli neurologicamente sani. La tecnica utilizzata è l’MS-HRM (High Resolution Melting Metilazione Sensibile). Il procedimento consiste nell’amplificazione del frammento contenente un certo numero di isole CpG rappresentative della regione promotrice da analizzare; successivamente si ottiene una curva di melting che permette di valutare, in base alle diverse temperature di denaturazione, un’eventuale differenza nel grado di metilazione delle isole CpG tra i diversi campioni analizzati. Il promotore di BACE1 ha mostrato un livello di metilazione del 100% in tutti i soggetti analizzati. Il sequenziamento diretto di un gruppo di campioni ha confermato che la sequenza in analisi era completamente metilata, confermando così il dato ottenuto con la MS-HRM. Inoltre, per confermare la validità del trattamento con sodio bisolfito, abbiamo utilizzato come controllo interno hMLH1, un gene generalmente ipometilato, che come atteso ha rivelato lo 0% di metilazione.