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• endometrite
• endometritis
• espressione genica
• gene expression
• immunohistochemistry
• immunoistochimica
• mare
• ozone therapy
• ozonoterapia

RIASSUNTO:
L’endometrite è la principale causa di subfertilità nella specie equina. L’alterata risposta immunitaria e l’inadeguata clearance uterina dopo l’accoppiamento che si verificano in alcune fattrici, favoriscono il perpetuarsi di una condizione infiammatoria uterina che può sfociare in uno stato cronico, caratterizzato da cambiamenti degenerativi e fibrotici dell’endometrio. La diagnosi dell’endometrite si basa su anamnesi riproduttiva, esami ecografici, batteriologici e citologici, ma il “gold standard” è tutt’oggi rappresentato dalla biopsia endometriale, soprattutto nelle forme subcliniche in quanto i segni clinici tendono a manifestarsi unicamente in seguito ad un evento riproduttivo. Il trattamento convenzionale dell’endometrite prevede l’esecuzione di lavaggi uterini e la somministrazione di farmaci ecbolici, antinfiammatori e antimicrobici. Tuttavia, la mancanza di una risposta adeguata ai trattamenti convenzionali negli ultimi anni ha stimolato lo sviluppo di terapie alternative. Recentemente, molecole come i peptidi antimicrobici (AMPs), implicati nella risposta immunitaria innata, sono state proposte come marcatori di endometrite, mentre l’ozonoterapia (O3) intrauterina si è affermata come trattamento alternativo per migliorare la qualità uterina e i tassi di gravidanza. Nella presente tesi sono stati condotti due studi. Nel primo, è stata valutata l’espressione genica endometriale di tre AMPs, quali defensina beta 4B (DEFB4B), lisozima (LYZ) e inibitore della peptidasi leucocitaria secretoria (SLPI), in 26 cavalle, confrontando animali affetti (EM, N=19) e non (NM, N=7) da endometrite subclinica. Un’espressione significativamente maggiore di LYZ, correlata positivamente con l’età e il grado istopatologico, e DEFB4B è stata osservata in EM rispetto a NM (P=0,0255 e P=0,0457, rispettivamente), suggerendo la possibilità di utilizzare questi AMPs come marcatori diagnostici per l’endometrite subclinica. Nel secondo, è stata valutata l’efficacia dell’insufflazione intrauterina di O3 in 11 cavalle vuote da almeno 1 anno nonostante il trattamento con terapie convenzionali. Dopo il trattamento, 10/11 cavalle hanno concepito (P<0,001) e 9/11 hanno dato alla luce un puledro vivo (P=0,002), con un miglioramento nel grado istopatologico in 5/11 animali. La quantità di tessuto fibroso, in termini di fibre di collagene, è risultata ridotta in modo tendenzialmente significativo dopo il trattamento con O3 in 8/11 cavalle (P=0,0674). Nessuna differenza è stata riscontrata, prima e dopo il trattamento con O3, nei livelli di espressione dei geni codificanti per metalloproteinasi e loro inibitori tissutali (MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2), implicati nel rimodellamento della matrice extracellulare, e per gli AMPs (DEFB4B, LYZ, SLPI), implicati nella risposta immunitaria innata. Similmente, non sono state evidenziate differenze nell’infiltrazione linfocitaria (CD3+, CD20+) e macrofagica (Iba-1+), fatta eccezione per la densità dei macrofagi M2 “rigenerativi” (CD163+) che sono risultati aumentati in modo statisticamente significativo dopo l’insufflazione intrauterina di O3 (P=0,0108), supportando l’efficacia dell’O3 nel migliorare i tassi di gravidanza e, potenzialmente, la qualità uterina. Questi studi sottolineano l’importanza di nuovi biomarcatori e terapie innovative come l’ozonoterapia per affrontare le sfide della subfertilità nella specie equina, evidenziando la necessità di ulteriori ricerche su campioni più ampi per confermare i risultati e ottimizzare le applicazioni cliniche.

ABSTRACT:
Endometritis is the most common cause of subfertility in the equine species. The altered immune response and inadequate uterine clearance after mating, observed in certain mares, promote the persistence of uterine inflammation, which can lead to a chronic state characterized by degenerative and fibrotic changes in the endometrium. The diagnosis of endometritis is based on reproductive history, ultrasonographic, bacteriological, and cytological examinations, but the "gold standard" remains endometrial biopsy, particularly in subclinical cases, as clinical signs tend to manifest only after a reproductive event. The conventional treatment of endometritis includes uterine lavages and the administration of ecbolics, anti-inflammatories, and antimicrobials. However, in recent years, the lack of efficacy of traditional therapeutic modalities, has enforced the development of alternative therapies. Recently, molecules such as antimicrobial peptides (AMPs), involved in innate immune response, have been proposed as markers of endometritis, while intrauterine ozone therapy (O3) has emerged as an alternative treatment to improve uterine quality and pregnancy rates. In this thesis, two studies were conducted. The first study evaluated the endometrial gene expression of three AMPs, defensin-beta 4B (DEFB4B), lysozyme (LYZ), and secretory leukocyte peptidase inhibitor (SLPI), in 26 mares either affected (EM, N=19) or not (NM, N=7) by subclinical endometritis. A significantly higher expression of LYZ, positively correlated with the age and the histopathological grade, and DEFB4B was observed in EM compared to NM (P=0.0255 and P=0.0457, respectively), suggesting the potential use of these AMPs as diagnostic markers for subclinical endometritis. The second study assessed the efficacy of intrauterine O3 insufflation in 11 mares, barren for at least one year despite conventional treatments. After treatment, 10/11 mares conceived (P<0.001), and 9/11 delivered a live foal (P=0.002), with an improvement in histopathological grade in 5/11 animals. The amount of fibrous tissue, in terms of collagen fibers, tended to decrease after O3 treatment in 8/11 mares (P=0.0674). No differences were observed between before and after O3 treatment in the levels of expression of genes encoding for metalloproteinases and their tissue inhibitors (MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2), involved in extracellular matrix remodeling, and for AMPs (DEFB4B, LYZ, SLPI), involved in innate immune response. Similarly, no differences were detected in lymphocytic (CD3+, CD20+) and macrophage (Iba-1+) infiltration, except for the density of regenerative M2 macrophages (CD163+), which significantly increased after intrauterine O3 insufflation (P=0.0108), supporting the efficacy of O3 in improving pregnancy rates and, potentially, uterine quality. These studies highlight the importance of new biomarkers and innovative therapies, such as ozone-therapy, in addressing the challenges of subfertility in equine species, emphasizing the need for further research on larger samples to confirm these findings and optimize clinical applications.