• antifouling
• bacteria bioactive compounds
• library screening
• nematode killing

The thesis is the result of one-year project carried out in the laboratory of University of New South Wales, Sydney, Australia. The project main aim was to develop an hight-throughput assay for the identification of bioactive compounds using the screening of a metagenomic library of E. coli clones.
The bacterial genus Pseudoalteromonas contains numerous marine species, which synthesize biologically active molecules. Many Pseudoalteromaonas species have been demonstrated to produce an array of low and high molecular weight compounds with antimicrobial, algicidal, neurotoxic and other pharmaceutically relevant activities.
P. tunicata is the best studied species within the genus. It lives in association with sessile eukaryotes such as algae and tunicates, and is a known producer of several bioactive compounds with activities towards other surface colonisers including bacteria, fungi, invertebrate larvae, diatoms, algal spores and protozoa.
The aim of this study is to identify the gene(s) involved in the synthesis of bioactive compounds in the marine bacterium P. tunicata that act against eukaryotic organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans was used in this study as a model eukaryote for screening bioactive compounds produced by P. tunicata. The development of a screen of a genomic library of P. tunicata DNA allowed for the identification of genes encoding for compounds acting against C. elegans.
Three positive clones with anti-nematode activity were found and there gene contents where analysed by genomic analysis and through random transposon mutagenesis.
The genes involved in the anti-nematode activity encode for a novel fast-killling protein, moreover a gene cluster for the biosynthesis of a small molecule was found out to be involved in the slow-killing activity.

Il batterio marino Pseudoalteromonas tunicata vive associato alla superficie di alghe e tunicati marini, possiede una pigmentazione verde-nera e produce una gamma di composti che inibiscono il fouling di larve di invertebrati, batteri, funghi e spore algali.
Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato lo sviluppo di uno specifico saggio anti-nematode ad alta risoluzione che permetta di individuare il gene responsabile della sintesi del composto anti-nematode e/o ricercare un suo possibile ortologo la cui attività sia nota nei genomi di altri organismi. Il saggio anti-nematode è stato realizzato attraverso lo screening di una libreria genomica, utilizzando come strumento di screening Caenorhabditis elegans. La libreria genomica utilizzata è stata creata inserendo un largo inserto di DNA di P. tunicata in Escherichia coli. Tre cloni positivi anti-nematode sono stati isolati attraverso lo screening della libreria, gli inserti di DNA sono stati estratti, sequenziati e trovata la loro posizione all’interno del genoma di P. tunicata. Gli inserti di DNA sono stati quindi reinseriti all’interno di E. coli creando una libreria di cloni knock-out, ognuno dei quali avesse una porzione dell’inserto di DNA silenziato, ed effettuando nuovamente lo screening di questa libreria contro C. elegans per identificare quale fosse il gene o i geni responsabili della sintesi del composto anti-nematode. I geni sono stati identificati e caratterizzati.
Sono state, inoltre, saggiate le capacità anti algali in un saggio anti-diatomee utilizzando P.tunicata wild type e mutanti knock-out (nella produzione di pigmenti) allo scopo di comprendere la correlazione tra attività anti algali e la produzione di pigmenti in P. tunicata.