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• patologie neurodegenerative
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L’autofagia rappresenta uno dei processi cruciali nel garantire la sopravvivenza e l’omeostasi metabolica cellulare. Questo meccanismo consente alla cellula di degradare e riciclare componenti intracellulari danneggiati o non funzionali, quali proteine misfolded (“mal ripiegate”), organelli e aggregati proteici, che, se non eliminati, potrebbero accumularsi e compromettere la vitalità cellulare o essere causa dell’insorgenza di alcune patologie. Il processo autofagico si può suddividere in tre fasi fondamentali. In particolare nella prima, sulla base di diversi segnali intracellulari e metabolici, si ha la formazione del fagoforo, una struttura a doppia membrana che, nello step successivo, estendendosi e assumendo la forma definitiva, si trasforma in autofagosoma.
Quest’ultimo ingloba il materiale da degradare e, infine, si fonde con i lisosomi, organelli ricchi di enzimi idrolitici che completano la degradazione del carico, scindendolo in molecole più semplici che vengono riciclate e riutilizzate dalla cellula, specialmente in condizioni di carenza di nutrienti o di stress. L’induzione dell’autofagia è dovuta agli ATG, una serie di geni autophagy-related, codificanti per proteine essenziali al processo che lavorano in sinergia con chinasi regolatrici, quali AMPK (AMP-activated protein kinase) ed mTORC1 (mechanistic target of rapamycin complex 1 kinase). Queste svolgono ruoli opposti e, in base allo stato energetico e nutrizionale in cui la cellula si trova, determinano se l’autofagia debba essere attivata o meno. In particolare, AMPK stimola il meccanismo, mentre mTORC1 lo inibisce. Il processo autofagico è quindi altamente regolato, ed una sua alterazione può portare a disfunzioni cellulari, all’accumulo di substrati tossici, agenti patogeni e aggregati proteici, tutti fattori spesso associati a diversi stati morbosi, tra cui sindrome metabolica, diabete mellito di tipo 2, malattie cardiovascolari, ma anche malattia di Alzheimer (AD) e Parkinson. Quest’ultime sono due delle patologie neurodegenerative più diffuse, e sono caratterizzate da aggregati di proteine insolubili, principalmente la β-amiloide (Aβ) e la proteina tau iperfosforilata per l’Alzheimer e l’α-sinucleina per il Parkinson. Accumulandosi, esse alterano la normale funzione neuronale, causando stress ossidativo, neuroinfiammazione e portando, infine, a morte cellulare. Come tutte la patologie neurodegenerative, il morbo di Alzheimer presenta una natura multifattoriale, contraddistinta da una grave neurodegenerazione che, a lungo termine, causa atrofia cerebrale associata a perdita progressiva delle funzioni cognitive, disturbi dell’umore, stati confusionali, perdita di memoria, alterazioni metaboliche e lipidiche. Inoltre, è stato osservato un accumulo di autolisosomi nelle cellule neuronali dei pazienti, fenomeno che indica un blocco nella fase terminale del processo di degradazione e che compromette la capacità delle cellule nervose di smaltire i detriti tossici, portando ad un peggioramento del danno neuronale ed accelerando la degenerazione del tessuto cerebrale. In questo contesto, quindi, è evidente quanto il processo autofagico sia essenziale nel promuovere la degradazione lisosomiale della β-amiloide, ma anche il turnover della proteina tau, prevenendone l’accumulo nei neuroni e riducendo la formazione dei grovigli neurofibrillari, che compromettono il normale funzionamento neuronale. Data la profonda complessità del morbo di Alzheimer, i target terapeutici validati risultano ancora carenti e le terapie farmacologiche attualmente disponibili, che includono gli inibitori delle colinesterasi (donepezil, rivastigmina, galantamina) e l’ antagonista del recettore NMDA memantina, offrono solo un sollievo parziale e temporaneo dai sintomi. Essi, infatti, migliorano la trasmissione nervosa o riducono l'eccessiva eccitazione neuronale, ma nessuno di questi è in grado di arrestare, rallentare o invertire il decorso della patologia. Alla luce di queste limitazioni, sono emerse nuove prospettive terapeutiche. In particolare, il gruppo di ricerca presso cui ho svolto la mia attività di tesi si è focalizzato sulla sintesi di derivati diarilmetanici, il cui scaffold centrale è costituito da due gruppi arilici legati a un carbonio metilenico. Tra i composti precedentemente sintetizzati, il derivato SG2 ha dimostrato un ottimo potenziale neuroprotettivo sia in modelli cellulari che in modelli preclinici di Caenorhabditis elegans per AD. In particolare, il ceppo di C. elegans impiegato è caratterizzato da una paralisi motoria indotta dalle placche di Aβ, e tale composto ne ha promosso il ripristino della motilità. Successivi studi di espressione genica condotti su entrambi i modelli hanno evidenziato come, tali effetti, possano essere correlati alla capacità di SG2 di stimolare il processo autofagico. Inoltre, studi preliminari di target deconvolution hanno dimostrato come questi composti siano in grado di interagire con HSP70 (Heat Shock Protein 70), una proteina chaperone che, in condizioni di stress cellulare quali shock termico, patologie o infezioni, previene l’aggregazione di proteine denaturate o misfolded e facilita il loro ripiegamento corretto, evitando la formazione di depositi tossici nelle cellule. Anche se ancora in fase esplorativa, inoltre, i medesimi studi hanno evidenziato come questi derivati possano anche interagire con MAP1, (MicrotubuleAssociated Protein 1), una proteina coinvolta nei processi di regolazione del citoscheletro e della degradazione proteica che, oltre a stabilizzare i microtubuli migliorando il traffico intracellulare, interagisce con LC3 (Microtubule-associated protein 1 light chain 3), essenziale per la formazione e maturazione degli autofagosomi. MAP1, in particolare, facilita il movimento degli autofagosomi lungo i microtubuli e permette loro di raggiungere i lisosomi e fondersi con essi, favorendo il processo autofagico. Nonostante tali target debbano essere ancora validati, tutto ciò evidenzia come questi composti siano delle molecole promettenti nel trattamento delle patologie neurodegenerative. Oltre agli studi fenotipici e di target deconvolution, SG2 è stato caratterizzato per il suo profilo ADME-Tox. I risultati acquisiti mostrano una relativa stabilità metabolica ma, alla concentrazione di 10 uM, SG2 mostra una leggera cardiotossicità a causa dell’inibizione del canale del potassio voltaggio dipendente hERG. Su queste basi, il mio progetto di laurea si è basato sulla sintesi di nuovi analoghi di SG2, al fine di migliorarne il profilo drug-like. Inoltre, ho anche avuto modo di testare tali composti sugli stessi modelli di AD di C. elegans citati in precedenza. I dettagli relativi alla sintesi degli analoghi di SG2, alle tecniche di purificazione, alla caratterizzazione degli intermedi e dei prodotti finali, e dei protocolli per i test biologici saranno oggetto di questa tesi di laurea.