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• esosomi
• hek 293
• miRNA
• RNA
• RNA interference
• siRNA

I farmaci a base di RNA rappresentano una strategia innovativa e promettente per trattare
patologie geniche grazie alla capacità di modulare direttamente l’espressione genica,
contrastando meccanismi patologici ove sono coinvolte tali disregolazioni a livello di uno
specifico RNA. Tuttavia, lo sviluppo di sistemi efficienti per il delivery intracellulare di RNA
terapeutici, come siRNA e miRNA, rimane una sfida fondamentale. I siRNA (small interfering
RNA) sono molecole di RNA a doppio filamento che agiscono sull’RNA messaggero di specifici
geni, permettendone il loro silenziamento; mentre i miRNA (microRNA) sono molecole
endogene di RNA che modulano l’espressione genica influenzando la traduzione o la stabilità
dell’mRNA. Entrambi rivestono un grande interesse terapeutico, poiché la loro capacità di
regolare l’espressione genica consente di intervenire in modo altamente specifico su sequenze
coinvolte in patologie geniche, oncologiche, cardiovascolari, metaboliche ecc, ripristinando il
corretto funzionamento biologico.
Gli esosomi sono vescicole secrete da tutte le cellule dell’organismo sia in condizioni
fisiologiche che patologiche, garantendo la comunicazione cellulare grazie al trasporto di RNA
codificanti e non codificanti, DNA, e proteine, influenzando l’attività delle cellule bersaglio.
Numerosi studi recentemente hanno proposto gli esosomi come sistemi di veicolazione
alternativi di molecole terapeutiche, inclusi gli RNA, considerandone l’alta biocompatibilità,
bassa immunogenicità e dimensioni nanometriche.
Lo scopo di questo progetto di tesi, verte sull’analizzare l’efficacia degli esosomi come vettori
per il delivery di RNA terapeutici, affrontando sfide legate ai processi di internalizzazione e post
internalizzazione. L’obiettivo finale è di sviluppare una strategia in grado di superare tali limiti,
rendendo gli esosomi ingegnerizzati strumenti terapeutici per il trattamento di patologie
geniche e metaboliche.
Gli esperimenti hanno visto in primo luogo, l’isolamento delle vescicole a partire da colture
cellulari di HEK 293. La tecnologia utilizzata per isolare gli esosomi è quella della Size Exclusion
Chromatography (SEC), alla base del funzionamento dell’AFC (Izon Science).
Successivamente le particelle sono state quantificate tramite dosaggio proteico (saggio BCA)
e strumento Exoid (Izon Science). Gli esosomi ottenuti sono stati caricati, seguendo un
protocollo di trasfezione precedentemente ottimizzato nel mio laboratorio, con una molecola
di siRNA diretta contro il trascritto del gene green fluorescent protein (GFP), un reporter
fluorescente che può essere usato per misurare la modulazione dell’espressione genica. Sono
stati preparati due campioni di esosomi: esosomi sottoposti a caricamento passivo (PL), come
controllo negativo, e esosomi trasfettati (TF). I due campioni sono stati innanzitutto
caratterizzati sia dimensionalmente sia tramite Western Blot, valutando che, in entrambi i casi,
il caricamento non vada a modificare la struttura della vescicola. Successivamente, i campioni
PL e TF sono stati usati per trattare una linea di HEK293 stabilmente trasfettata col reporter
GFP, e la riduzione dell’RNA messaggero della proteina GFP è stato quantificata. A 72 h dal
trattamento, l’utilizzo di 10⁹ esosomi TF, corrispondenti ad una concentrazione di siRNA di 0,04
nM, ha dimostrato un silenziamento della GFP pari al 40% rispetto alle condizioni di controllo,
comparabile a quanto ottenuto con un reagente di trasfezione commerciale. Al contrario,
concentrazioni più elevate, pari a come 10¹⁰ esosomi TF, corrispondenti ad una concentrazione
di siRNA di circa 0,4 nM, non ha prodotto ulteriori riduzioni nell’espressione del reporter.
Parallelamente, gli esosomi TF sono stati caricarti anche con molecole di anti-miR-375, in
grado di ridurre l’espressione del miR-375. Questo microRNA è coinvolto nella regolazione
negativa dell’espressione della Myotrophin (Mtpn), nelle cellule β-pancreatiche, intervenendo
nella Secrezione di insulina stimolata dal glucosio (GSIS). Pertanto, utilizzando un suo
antagonista, dovrebbe essere possibile aumentare il rilascio di insulina a seguito
dell’innalzamento dei valori di glucosio nel sangue, un approccio che potrebbe trovare
applicazione in caso di patologia diabetica. Valutando i risultati ottenuti effettuando lo stesso
trattamento sopra descritto in un modello di cellule β-pancreatiche (EndoC- βH1), non c’è stata
una significativa riduzione del miR-375, né un aumento del gene Mtpn. Una spiegazione a
questo risultato potrebbe essere una minore interazione del bilayer fosfolipidico dell’esosoma
derivato da cellule HEK293 con le membrane delle cellule β-pancreatiche.
Per aumentare l’interazione delle membrane degli esosomi con quelle delle cellule recipienti,
è stata indagata la possibilità di ingegnerizzazione degli esosomi tramite proteina VSVG
(Vesicular Stomatitis Virus Glycoprotein), col fine ultimo di incrementare il rilascio
intracellulare di RNA. Per ottenere EVs decorati con VSVG, sono state trasfettate cellule HEK
293 con un plasmide codificante per la proteina in questione. Gli esosomi EVs-VSVG sono stati
caricati con siRNA-anti-GFP, e l’efficienza di trasfezione valutata in cellule HEK esprimenti GFP
valutando i livelli di espressione di quest’ultima, sia a livello del trascritto che della proteina.
Inoltre, sono state quantificate, utilizzando un kit commerciale specifico per la
retrotrascrizione e quantificazione (PCR) di siRNA, anche le copie di siRNA effettivamente
rilasciate nelle cellule dopo questa funzionalizzazione. I risultati ottenuti dall’indagine hanno
dimostrato che gli esosomi decorati hanno un effetto di silenziamento migliore rispetto alle
controparti non trasfettate. Infine, per verificare che la presenza della glicoproteina non alteri
la composizione proteica degli esosomi, è stata caratterizzata la presenza di marker costituitivi
di membrana CD9 e CD81 tramite Western Blot.
In conclusione, dagli studi e risultati ottenuti, è emersa una buona capacità degli esosomi di
deliverare molecole di piccoli RNA non codificanti; tuttavia, ci sono delle limitazioni dovute
probabilmente sia ai processi di internalizzazione che a quelli post-internalizzazione. La
strategia di decorare la membrana con VSVG sembrerebbe aver migliorato il delivery degli
esosomi, ma ulteriori studi futuri sono necessari per valutare l’efficienza degli EVs-VSVG anche
su altre linee cellulari come EndoC-βH1. Un altro aspetto che potrebbe essere spunto per
ulteriori indagini è quello di valutare se effettuando un trattamento su cellule EndoC-βH1 con
esosomi prodotti dalle stesse cellule β-pancreatiche, possa ridurre in maniera significativa
l’espressione del miR-375, aprendo così la via ad una possibile applicazione anche in caso di
patologie diabetiche.