ETD

• cellule Hek 293T
• cellule PC12
• esosomi
• exosomes
• extracellular vesicles
• neurodegeneration
• neurodegenerazione
• neurotrophic signaling
• NGF
• recettori TrkA e p75
• segnalazione neurotrofica
• vescicole extracellulari

Le Vescicole Extracellulari (Extracellular Vesicles, EV) sono piccole strutture prodotte da tutte le cellule, aventi dimensioni nanometriche e rivestimento di membrana fosfolipidica. Le EV rappresentano un sistema di comunicazione intercellulare altamente specializzato, capace di trasferire proteine, lipidi e acidi nucleici funzionali e di modulare numerosi processi fisiologici e patologici. Grazie alla loro elevata biocompatibilità, bassa immunogenicità e capacità di attraversare barriere biologiche, inclusa la barriera emato-encefalica, le EV e in particolare gli esosomi, aventi diametro compreso tra 30 e 150 nm, sono oggi considerati promettenti vettori terapeutici. Gli esosomi si originano prevalentemente dalla via endosomiale, attraverso la formazione di vescicole intraluminali all’interno dei corpi multivescicolari, che, fondendosi con la membrana plasmatica, ne consentono il rilascio nello spazio extracellulare. In particolare, nel sistema nervoso (SN) gli esosomi svolgono un ruolo chiave nella comunicazione neuronale e gliale, contribuendo sia ai meccanismi di omeostasi sia alla propagazione di segnali patologici. Essi veicolano RNA regolatori, tra cui mRNA, miRNA, lncRNA e circRNA, in grado di rimodellare l’espressione genica delle cellule bersaglio. Tale proprietà risulta particolarmente rilevante nelle patologie neurodegenerative, come Alzheimer e Parkinson. Nelle stesse, gli esosomi sono anche coinvolti nella diffusione patologica di aggregati proteici tossici e per questo rappresentano sia potenziali biomarcatori che promettenti target terapeutici.
Nel SN, il sistema delle neurotrofine svolge un ruolo cruciale nel neurosviluppo, guidando la sopravvivenza, la differenziazione e la plasticità neuronale, e mantiene la sua importanza in età adulta, dove alterazioni della sua segnalazione contribuiscono a processi neurodegenerativi. La prima neurotrofina a essere scoperta è il fattore di crescita nervoso (NGF), che esercita la sua attività neurotrofica mediante legame e attivazione dei suoi recettori TrkA e P75NTR, presenti nella maggior parte dei neuroni del SN periferico e nella popolazione colinergica del SN centrale. L’equilibrio tra queste due vie recettoriali determina l’esito biologico della segnalazione, regolando sopravvivenza, differenziamento e apoptosi neuronale. Alterazioni di questo sistema sono state correlate a numerose malattie neurodegenerative. Tuttavia, un possibile ruolo delle EV, in particolare quelle neuronali, nel modulare questa via di segnalazione risulta ad oggi pressoché inesplorato.
Il presente lavoro di tesi è stato finalizzato alla produzione e caratterizzazione di esosomi di origine neuronale e alla valutazione del loro potenziale neurotrofico nel modello cellulare PC12, che esprimendo alti livelli di recettori TrkA e P75NTR costituisce un sistema estremamente utile e consolidato per lo studio del differenziamento neuritico NGF-dipendente. In particolare, lo studio è stato improntato a chiarire se tali EV hanno attività neurotrofica e se questa sia attribuibile esclusivamente al contenuto intravescicolare o se piuttosto derivi anche dalla presenza di recettori neurotrofici sulla superficie esosomiale. Per rispondere a questi quesiti, le EV sono state prodotte sia dalle stesse cellule PC12 che dalla linea di cellule non neuronale HEK 293T 17; queste ultime sono state sottoposte a trasfezione con plasmidi codificanti per i recettori neurotrofici TrkA e P75NTR, al fine di indurne l’espressione. Le EV sono state isolate mediante concentrazione con filtri Amicon e cromatografia SEC. Le vescicole sono state quantificate tramite tecnologia Tunable Resistive Pulse Sensing (TRPS) con strumento Exoid, consentendo la determinazione della concentrazione e delle dimensioni, mentre il contenuto proteico è stato valutato tramite saggio BCA. La caratterizzazione proteica dei lisati cellulari ed esosomi è stata effettuata mediante SDS-PAGE e Western Blot. L’efficienza della trasfezione è stata, invece, verificata 24 ore dopo mediante osservazione al microscopio ottico in brightfield e in fluorescenza. Per valutare l’attività biologica delle EV così ottenute, queste sono state somministrate a cellule PC12 in assenza o in presenza di concentrazioni crescenti di NGF. Il differenziamento neuritico è stato analizzato mediante microscopia ottica in campo chiaro e quantificato tramite software Fiji, calcolando la densità e la lunghezza totale dei neuriti, con successiva elaborazione statistica tramite GraphPad Prism. I risultati mostrano che dosaggi crescenti di EV somministrati a 20.000 cellule per pozzetto, da 1 a 2.5 µg, determinano un potenziamento progressivo della crescita neuritica a parità di concentrazione di NGF, mentre quantità superiori a 2.5 µg inducono una marcata riduzione del differenziamento. Ciò indica l’esistenza di una finestra di concentrazione ottimale per l’attività neurotrofica delle EV. Inoltre, l’effetto neurotrofico è stato osservato anche con gli esosomi ingegnerizzati, dato attribuibile all’integrazione di TrkA e P75NTR nella membrana delle cellule bersaglio, con aumento della densità recettoriale e possibile formazione di complessi ad alta affinità per NGF, in grado di modulare il bilanciamento tra vie TrkA-dipendenti pro-sopravvivenza e P75NTR-dipendenti pro-apoptotiche. È emerso inoltre che anche esosomi non trasfettati sono in grado di potenziare la risposta all’NGF, suggerendo un contributo significativo del contenuto intrinseco delle EV, costituito da RNA regolatori e molecole di superficie bioattive, capaci di modulare indirettamente i pathway intracellulari e la sensibilità delle PC12 alla stimolazione neurotrofica. Nel complesso, questo studio fornisce evidenze a supporto del ruolo degli esosomi come modulatori attivi della risposta neurotrofica e pone le basi per futuri sviluppi di strategie terapeutiche basate su EV ingegnerizzate per il trattamento delle patologie neurodegenerative e dei danni al sistema nervoso.

Extracellular Vesicles (EVs) are small structures produced by all cells, characterized by nanometric dimensions and a phospholipid bilayer membrane. EVs represent a highly specialized system of intercellular communication, capable of transferring functional proteins, lipids, and nucleic acids and of modulating numerous physiological and pathological processes. Owing to their high biocompatibility, low immunogenicity, and ability to cross biological barriers, including the blood–brain barrier, EVs—particularly exosomes, with a diameter ranging from 30 to 150 nm—are currently regarded as promising therapeutic vectors. Exosomes mainly originate from the endosomal pathway through the formation of intraluminal vesicles within multivesicular bodies, which, upon fusion with the plasma membrane, allow their release into the extracellular space.
In the nervous system (NS), exosomes play a key role in neuronal and glial communication, contributing both to homeostatic mechanisms and to the propagation of pathological signals. They carry regulatory RNAs, including mRNA, miRNA, lncRNA, and circRNA, which are able to remodel gene expression in target cells. This property is particularly relevant in neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s and Parkinson’s disease. In these conditions, exosomes are also involved in the pathological spread of toxic protein aggregates and therefore represent both potential biomarkers and promising therapeutic targets.
Within the NS, the neurotrophin system plays a crucial role in neurodevelopment by guiding neuronal survival, differentiation, and plasticity, and it remains important in adulthood, where alterations in its signaling contribute to neurodegenerative processes. The first neurotrophin to be discovered was nerve growth factor (NGF), which exerts its neurotrophic activity through binding to and activation of its receptors TrkA and p75^NTR, expressed in most neurons of the peripheral NS and in the cholinergic population of the central NS. The balance between these two receptor-mediated pathways determines the biological outcome of signaling, regulating neuronal survival, differentiation, and apoptosis. Dysregulation of this system has been associated with numerous neurodegenerative diseases. However, a potential role of EVs, particularly neuron-derived EVs, in modulating this signaling pathway remains largely unexplored to date.
The present thesis work was aimed at the production and characterization of neuron-derived exosomes and at the evaluation of their neurotrophic potential in the PC12 cellular model, which, by expressing high levels of TrkA and p75^NTR receptors, represents a highly useful and well-established system for studying NGF-dependent neuritic differentiation. Specifically, the study sought to determine whether these EVs exhibit neurotrophic activity and whether this activity can be attributed exclusively to their intravesicular cargo or also to the presence of neurotrophic receptors on the exosomal surface. To address these questions, EVs were produced both from PC12 cells and from the non-neuronal HEK 293T/17 cell line; the latter were transfected with plasmids encoding the neurotrophic receptors TrkA and p75^NTR in order to induce their expression. EVs were isolated by Amicon filter-based concentration and size-exclusion chromatography (SEC). Vesicles were quantified using Tunable Resistive Pulse Sensing (TRPS) technology with an Exoid instrument, allowing determination of particle concentration and size, while protein content was assessed by BCA assay. Protein characterization of cell lysates and exosomes was performed by SDS-PAGE and Western blotting. Transfection efficiency was verified 24 hours later by observation under bright-field and fluorescence optical microscopy.
To evaluate the biological activity of the obtained EVs, they were administered to PC12 cells in the absence or presence of increasing concentrations of NGF. Neuritic differentiation was analyzed by bright-field optical microscopy and quantified using Fiji software by calculating neurite density and total neurite length, followed by statistical analysis with GraphPad Prism. The results show that increasing doses of EVs administered to 20,000 cells per well, ranging from 1 to 2.5 µg, induce a progressive enhancement of neuritic outgrowth at a fixed NGF concentration, whereas amounts exceeding 2.5 µg lead to a marked reduction in differentiation. This indicates the existence of an optimal concentration window for the neurotrophic activity of EVs.
Moreover, a neurotrophic effect was also observed with engineered exosomes, an effect attributable to the integration of TrkA and p75^NTR into the membrane of target cells, resulting in increased receptor density and possible formation of high-affinity NGF receptor complexes, capable of modulating the balance between pro-survival TrkA-dependent pathways and pro-apoptotic p75^NTR-dependent pathways. It was also found that non-transfected exosomes are able to enhance the response to NGF, suggesting a significant contribution of the intrinsic EV cargo, consisting of regulatory RNAs and bioactive surface molecules capable of indirectly modulating intracellular pathways and increasing PC12 sensitivity to neurotrophic stimulation.
Overall, this study provides evidence supporting the role of exosomes as active modulators of the neurotrophic response and lays the groundwork for future development of therapeutic strategies based on engineered EVs for the treatment of neurodegenerative diseases and nervous system injuries.