• chitosano
• nanoparticelle
• peptidi antimicrobici
• Staphylococcus epidermidis
• temporina 1b

Le problematiche associate al trattamento delle infezioni sostenute da microrganismi resistenti agli antibiotici hanno orientato l’interesse della ricerca scientifica verso l’identificazione di agenti antimicrobici innovativi. Negli ultimi anni, i peptidi ad attività antimicrobica hanno attirato crescente interesse grazie alla loro azione battericida rapida e ad ampio spettro, alla specificità di target e alla bassa frequenza nella selezione di ceppi resistenti. Tuttavia, il loro impiego terapeutico è limitato dalla loro scarsa stabilità nei fluidi biologici e dalla loro potenziale tossicità in vivo. L’incapsulamento di tali peptidi all’interno di nanoparticelle polimeriche potrebbe offrire numerosi vantaggi, tra cui il parziale controllo della farmacocinetica, la riduzione della tossicità sistemica e l’aumento di biodisponibilità ed emivita in circolo.
Il presente lavoro di tesi è incentrato sulla preparazione, caratterizzazione chimico-fisica e valutazione biologica di nanoparticelle a base di chitosano caricate con temporina, un peptide antimicrobico isolato dalla cute della rana rossa europea. Il chitosano è stato selezionato per la formulazione di questi sistemi in quanto risulta altamente biocompatibile e biodegradabile e presenta proprietà antimicrobiche intrinseche. Le nanoparticelle sono state preparate mediante gelificazione ionotropica utilizzando come agente reticolante il tripolifosfato. La caratterizzazione dimensionale ha mostrato un diametro medio inferiore ai 200 nm, mentre l’analisi della carica superficiale ha rilevato una carica netta positiva. L’efficienza di incapsulamento ed il caricamento (o loading) della temporina sono state analizzate attraverso il saggio colorimetrico dell’acido bicinconinico, risultando rispettivamente pari a 75% e 4.8%. Lo studio della cinetica di rilascio del farmaco ha evidenziato un profilo di rilascio lineare durante le due settimane in cui è stato svolto il test. La valutazione della citotossicità in vitro, condotta utilizzando la linea cellulare di fibroblasti murini embrionali balb/3T3 clone A31, ha mostrato una buona citocompatibilità dei nanosistemi preparati e una riduzione significativa della tossicità della temporina in forma incapsulata. L’attività antibatterica del sistema è stata valutata per un periodo di quattro giorni su Staphylococcus epidermidis, un batterio Gram-positivo sempre più frequentemente coinvolto in infezioni opportunistiche in ambiente nosocomiale. I risultati ottenuti hanno dimostrato che le nanoparticelle caricate con temporina sono in grado di assicurare una prolungata attività battericida di intensità statisticamente superiore rispetto a quella esercitata dalle particelle non caricate e dal peptide libero. L’ultima parte del lavoro di tesi è stata dedicata, infine, all’analisi dell’attività battericida ed emolitica di analoghi sintetici della temporina. Sono stati identificati due peptidi più attivi e meno tossici della temporina parentale, che potranno essere impiegati per la realizzazione di sistemi nanoparticellari con proprietà antimicrobiche ulteriormente ottimizzate.

Problems associated with the treatment of antibiotic-resistant bacterial infections have guided research interests towards the identification of novel antimicrobial agents. Over the last years, antimicrobial peptides have attracted increasing attention because of the rapid and broad-spectrum bactericidal activity, the target specificity and the low frequency in selection of resistant strains. However, their therapeutic use is limited by their poor stability in biological fluids and their potential toxicity in vivo. Encapsulation of such peptides into polymeric nanoparticles could offer several advantages, including the partial control of pharmacokinetics, the reduction of systemic toxicity and the increase of bioavailability and plasma half-life.
The present work focuses on preparation, physicochemical characterization and biological evaluation of chitosan-based nanoparticles loaded with temporin, an antimicrobial peptide isolated from the skin of the European red frog. Chitosan was selected for the development of these systems due to its high biocompatibility, biodegradability and its inherent antimicrobial properties.
Nanoparticles were prepared by ionotropic gelation method using tripolyphosphate as cross-linking agent. The dimensional characterization showed a mean diameter lower than 200 nm, while the surface charge analysis revealed a net positive charge. The encapsulation efficiency and the loading of temporin were analyzed by means of the bicinchoninic acid assay, resulting equal to 75% and 4.8% respectively. Studies on drug release kinetics highlighted a linear release profile during two weeks of testing. In vitro evaluation of cytotoxicity, performed using the mouse embryo fibroblast cell line balb/3T3 clone A31, showed a good cytocompatibility of the developed nanosystems and a significant toxicity reduction of encapsulated temporin. The antibacterial activity of the system was evaluated for four days against Staphylococcus epidermidis, a Gram-positive bacterial species increasingly involved in opportunistic nosocomial infections. The results obtained demonstrated that temporin-loaded nanoparticles are able to exert a prolonged bactericidal activity statistically higher than that exerted by unloaded nanoparticles and free peptide.
Lastly, part of the research activity was dedicated to the assessment of the bactericidal and haemolytic activity of synthetic temporin analogues. We have identified two peptides more effective and less toxic than the native temporin, which may be used for manufacturing nanoparticles with improved antimicrobial properties.