• citocromo P450
• mucosa nasale
• suino

Il sistema citocromo P450 (CYP) è una superfamiglia enzimatica che svolge un ruolo fisiologico importante nel metabolismo di sostanze endogene ed esogene, costituita da emoproteine che appartengono alla sottoclasse delle ossidasi a funzione mista. Si tratta di enzimi di fase I presenti prevalentemente a livello epatico, ma che generalmente si riscontrano anche in molti tessuti extraepatici. Nei mammiferi, sebbene il fegato presenti il più alto contenuto di CYP, anche il tratto respiratorio e, soprattutto, la mucosa nasale olfattiva, mostrano livelli significativi di CYP e isoforme tessuto-specifiche. La presenza dei CYPs in questo tessuto con funzione chemiosensoriale appare importante per il mantenimento dell'omeostasi, la trasformazione metabolica di molecole odorose e la protezione del cervello da agenti chimici inalati.
In questo lavoro di tesi è stato scelto il suino come modello sperimentale perché presenta caratteristiche metaboliche ed anatomiche simili all'uomo, ed è quindi stato proposto come nuovo modello negli studi di farmacologia e tossicologia in alternativa ad altri grandi animali come il cane o la scimmia. Tuttavia le conoscenze sul sistema metabolico del suino, ed in particolare sui CYPs, sono ancora scarse.
E' noto da studi precedenti, che il fenobarbital, un barbiturico usato diffusamente come farmaco fino agli anni '60, è in grado di indurre nell'uomo i CYP2B, 2C e 3A a livello epatico tramite l'attivazione dei recettori nucleari constitutive androstane receptor (CAR) e, indirettamente, pregnane X receptor (PXR). Sebbene alcuni lavori indicassero una refrattarietà all'induzione da fenobarbital da parte delle isoforme di CYPs presenti nella mucosa nasale di mammifero, nessuno studio era ancora stato condotto in maniera esauriente ed approfondita nel suino. Scopo di questa tesi è stato quello di investigare, a livello trascrizionale, proteico e di attività enzimatica, se l'espressione dei CYP2B, 2C e 3A nelle mucose olfattiva e respiratoria di suino fosse o meno modulabile dal trattamento con fenobarbital. I risultati sono stati comparati con quelli del tessuto epatico.
Basandosi sulle sequenze geniche dei vari CYP2B, 2C e 3A di suino note in banca dati, sono stati disegnati primers specifici per i CYP2B22, 2C33, 2C42, 2C49, 3A22, 3A29 e 3A46. E' stato estratto e retrotrascritto l'RNA totale proveniente da campioni di fegato e di mucosa nasale olfattiva e respiratoria prelevati da quattro suini di controllo e quattro suini trattati in vivo con fenobarbital intraperitonealmente ad una dose di 20mg/kg per tre giorni consecutivi. Con il cDNA ottenuto sono stati eseguiti esperimenti di amplificazione genica mediante RT-PCR qualitativa. Una parte dei tessuti prelevati è servita per la preparazione dei microsomi, poi utilizzati per i saggi biochimici. A livello di attività enzimatica, i vari CYPs sono stati investigati utilizzando alcune attività marcatrici dei vari CYP2B, 2C e 3A umani: deetilazione della 7-etossi-4-trifluorometilcumarina (EFCOD) e ossidazione dell'antraldeide per il CYP2B6, demetilazione della 7-metossi-4-trifluorometilcumarina (MFCOD) per i CYP2C e idrossilazione della tolbutamide per il CYP2C9, debenzilazione della benzilossichinolina e demetilazione della eritromicina per il CYP3A4.
Le analisi di RT-PCR hanno mostrato che tutte le isoforme di CYP considerate sono espresse costitutivamente nel fegato e nella mucosa nasale sia olfattiva che respiratoria. Tali esperimenti, ancora in corso, sembrano tuttavia dimostrare che la loro espressione non è chiaramente inducibile in seguito a trattamento con fenobarbital nei due tipi di mucosa considerati, al contrario di quanto riscontrato ampiamente nel fegato da esperimenti condotti in precedenza in questo laboratorio. Tutte le attività enzimatiche effettuate, condotte con microsomi di mucosa olfattiva e respiratoria, non hanno evidenziato, in generale, un aumento dell'attività negli animali trattati rispetto ai controlli, al contrario di quanto precedentemente riscontrato a livello epatico. Inoltre, le attività basali riscontrate nella mucosa olfattiva sono risultate essere molto più alte rispetto a quelle della respiratoria.
Sono in corso esperimenti di Western blot, effettuati mediante l'utilizzo di anticorpi policlonali anti-CYP2B6, 2C9 e 3A4 umani e anti-CYP2C11 di ratto.
In conclusione, i dati ottenuti dimostrano che nelle mucose olfattiva e respiratoria di suino sono espresse costitutivamente almeno una isoforma di CYP2B (2B22), tre di 2C (2C33, 2C42 e 2C49) e tre di 3A (3A22, 3A29 e 3A46) e che nessuna di queste isoforme è inducibile da fenobarbital sia a livello trascrizionale che di attività enzimatica.