ETD

• Aceruloplasminemia
• Ceruloplasmin
• Immunoglobulin
• receptor Neonatal Fc (FcRn)
• recombinant
• ricombinante

Il ferro è un metallo cruciale nell’uomo poiché svolge un ruolo chiave nel trasporto dell’ossigeno, nella respirazione mitocondriale, nella sintesi del DNA e in altre funzioni biologiche. Tuttavia, le stesse proprietà che rendono il ferro essenziale possono anche portare a tossicità mediata da stress ossidativo. Per questo motivo, l’organismo ha sviluppato meccanismi omeostatici strettamente controllati per garantire adeguatamente assorbimento, trasporto e immagazzinamento del ferro, evitandone un accumulo tossico. In questo contesto, la ceruloplasmina (CP), una ferrossidasi multi-rame secreta dagli epatociti, catalizza la conversione della forma ridotta tossica del ferro Fe²⁺ nella forma ossidata Fe³⁺. Il ferro ossidato poi si associa alla transferrina (TF) nel sangue, che lo distribuisce in periferia, nei tessuti che necessitano di ferro, in primis il midollo osseo che effettua emopoiesi.
Particolari mutazioni a carico del gene CP causano l’aceruloplasminemia (ACP), una rara malattia autosomica recessiva caratterizzata dall’accumulo di ferro a livello sistemico e cerebrale, determinando un quadro clinico caratterizzato da anemia, diabete mellito e neurodegenerazione progressiva. Le terapie attuali, inclusi i chelanti del ferro e le trasfusioni di plasma fresco congelato, forniscono benefici limitati, mentre studi preclinici su modelli murini CP-KO hanno dimostrato che la sostituzione della CP ristabilisce l’omeostasi cerebrale del ferro e riduce la neurodegenerazione, supportando la terapia enzimatica sostitutiva come strategia razionale per l’ACP. Spesso, a seguito dell’impiego di plasma-derivati, lo sviluppo di terapie ricombinanti rappresenta il passo successivo per migliorare il profilo farmacocinetico e farmacodinamico della CP. In questo contesto, la coniugazione con il frammento cristallizzabile (dominio effettore Fc) delle Immunoglobuline G1 rappresenta una delle strategie più diffuse nei farmaci biologici per aumentare l’emivita degli stessi, sfruttando il riciclo cellulare mediato dal recettore Neonatal Fc (FcRn). Questo recettore è responsabile della lunga persistenza in circolo delle IgG (circa 3 settimane), con l’obiettivo di prolungare l’emivita sierica dell’enzima, ridurre la frequenza di somministrazione e migliorare l’aderenza e la sostenibilità della terapia, mantenendo inalterata l’efficacia biologica.
Sulla base di tale letteratura, in questo lavoro di tesi, abbiamo sviluppato e caratterizzato una variante bio-ingegnerizzata di CP, finalizzata a superare i limiti farmacocinetici della CP nativa. In particolare, è stata progettata una CP ricombinante fusa alla porzione Fc delle IgG1 (R-CP-Fc). L’obiettivo finale di questo progetto di tesi, condotto in Kedrion Biopharma, azienda leader nella raccolta del plasma e nella produzione di terapie plasmaderivate per patologie rare, è stato la produzione della proteina R CP Fc chimerica e la sua successiva caratterizzazione in vitro.
A tal fine, la R-CP-Fc è stata espressa con successo in cellule umane HEK293T/17, un sistema ampiamente utilizzato per l’espressione eterologa transiente di proteine. La proteina R-CP-Fc è stata purificata mediante cromatografia di affinità, e caratterizzata in saggi in vitro, biochimici e funzionali, confrontandone le proprietà con quelle della CP ricombinante wild-type (R-CP WT). La caratterizzazione funzionale ha mostrato che la R-CP-Fc mantiene l’attività ferrossidasica fisiologica della CP. In parallelo, l’interazione tra il dominio Fc della proteina di fusione e il recettore FcRn, è stata valutata mediante la tecnologia Homogeneous Time-Resolved Fluorescence (HTRF), evidenziando un’interazione stabile e ad alta affinità tra R-CP-Fc e FcRn umano, supportando la capacità della proteina di sfruttare il meccanismo fisiologico di riciclo mediato da FcRn e suggerendo quindi una potenziale estensione della sua emivita in vivo.
Questo approccio potrebbe rappresentare quindi una strategia razionale per migliorare il profilo terapeutico della CP e supportare il potenziale della proteina Fc-fusa come candidato innovativo per il trattamento dell’ACP, fornendo una solida base preclinica in vitro per il suo ulteriore sviluppo. Inoltre, i dati ottenuti in questo progetto aprono diverse prospettive future indirizzate ad una possibile applicazione in vivo. Un primo aspetto, per esempio, riguarda la progettazione di una versione più efficiente della proteina ricombinante, al fine di ridurre il rischio di una risposta immunitaria. Un ulteriore sviluppo potrebbe riguardare l’ottimizzazione della sequenza Fc mediante strategie di ingegneria proteica volte a migliorare l’interazione con il recettore FcRn o a favorire una distribuzione più ampia nei tessuti. In questo contesto, varianti di Fc progettate per facilitare il passaggio attraverso la barriera emato-encefalica potrebbe rappresentare un’opzione interessante, specialmente in quadri clinici di neurodegenerazione. Infine, dal punto di vista produttivo, l’adozione di sistemi cellulari di espressione ad alta resa, come le cellule Expi293F, rappresenterebbe un passaggio chiave per la scalabilità e per i futuri studi preclinici avanzati.

Iron is a crucial metal in humans, playing a key role in oxygen transport, mitochondrial respiration, DNA synthesis, and other biological functions. However, the same properties that make iron essential can also lead to toxicity mediated by oxidative stress. Consequently, the body has developed strictly controlled homeostatic mechanisms to ensure proper iron absorption, transport, and storage, thereby preventing toxic accumulation. In this context, ceruloplasmin (CP), a multi-copper ferroxidase secreted by hepatocytes, catalyzes the conversion of the toxic reduced form of iron Fe2+ into the oxidized form Fe3+. Oxidized iron then binds to transferrin (TF) in the blood, which distributes it to peripheral tissues requiring iron—primarily the bone marrow for hematopoiesis.
Specific mutations in the CP gene cause aceruloplasminemia (ACP), a rare autosomal recessive disorder characterized by systemic and cerebral iron accumulation. This results in a clinical presentation defined by anemia, diabetes mellitus, and progressive neurodegeneration. Current therapies, including iron chelators and fresh frozen plasma transfusions, provide limited benefits. Meanwhile, preclinical studies on CP-knockout (CP-KO) mouse models have demonstrated that CP replacement restores cerebral iron homeostasis and reduces neurodegeneration, supporting enzyme replacement therapy (ERT) as a rational strategy for ACP.
Following the use of plasma-derived products, the development of recombinant therapies represents the next step in improving the pharmacokinetic and pharmacodynamic profiles of CP. In this regard, conjugation with the crystallizable fragment (Fc effector domain) of Immunoglobulin G1 (IgG1) is one of the most widely used strategies in biologics to increase half-life. This approach leverages cellular recycling mediated by the neonatal Fc receptor (FcRn), which is responsible for the long circulation persistence of IgGs (approximately 3 weeks). The goal is to extend the enzyme's serum half-life, reduce dosing frequency, and improve therapeutic adherence and sustainability while maintaining biological efficacy.
Based on this literature, this thesis project involved the development and characterization of a bio-engineered variant of CP designed to overcome the pharmacokinetic limitations of native CP. Specifically, a recombinant CP fused to the Fc portion of IgG1 (R-CP-Fc) was engineered. The ultimate objective of this project, conducted at Kedrion Biopharma—a leading company in plasma collection and the production of plasma-derived therapies for rare diseases—was the production of the chimeric R-CP-Fc protein and its subsequent in vitro characterization.
To this end, R-CP-Fc was successfully expressed in human HEK293T/17 cells, a system widely used for the transient heterologous expression of proteins. The R-CP-Fc protein was purified via affinity chromatography and characterized through in vitro, biochemical, and functional assays, comparing its properties with those of wild-type recombinant CP (R-CP WT). Functional characterization showed that R-CP-Fc maintains the physiological ferroxidase activity of CP. In parallel, the interaction between the Fc domain of the fusion protein and the FcRn receptor was evaluated using Homogeneous Time-Resolved Fluorescence (HTRF) technology. This highlighted a stable, high-affinity interaction between R-CP-Fc and human FcRn, supporting the protein's ability to utilize the physiological FcRn-mediated recycling mechanism and suggesting a potential extension of its in vivo half-life.
This approach may represent a rational strategy to enhance the therapeutic profile of CP and supports the potential of the Fc-fused protein as an innovative candidate for ACP treatment, providing a solid in vitro preclinical foundation for further development.
Furthermore, the data obtained in this project open several future perspectives for in vivo applications. One aspect involves designing a more efficient version of the recombinant protein to reduce the risk of an immune response. Further development could involve optimizing the Fc sequence through protein engineering strategies to improve FcRn interaction or promote broader tissue distribution. In this context, Fc variants designed to facilitate crossing the blood-brain barrier could represent an interesting option, especially for clinical cases involving neurodegeneration. Finally, from a manufacturing perspective, adopting high-yield cellular expression systems, such as Expi293F cells, would be a key step for scalability and future advanced preclinical studies.