ETD

• 5' RACE
• Motor behavior
• Motor system development
• Neurodevelopmental disorder
• Pitt Hopkins Syndrome
• PTHS
• TCF4
• Zebrafish knock-out

Pitt Hopkins Syndrome (PTHS) is a rare neurodevelopmental disorder caused by pathogenic variants of the TCF4 gene which encodes a class I bHLH transcription factor. This syndrome is characterized by a plethora of symptoms: atypical facial gestalt, intellectual disability with absence of speech and global developmental delay affecting respiratory, gastrointestinal and motor systems. In particular, patients show muscle hypotonia and motor incoordination, whose developmental origin has not yet been elucidated. My thesis focused on investigating this aspect on a tcf4 knock-out zebrafish line previously generated in the laboratory using the CRISPR/Cas9 system. The analyses reported in this thesis were conducted on heterozygous tcf4 knock-out zebrafish embryos at different developmental stages to characterize the motor system development and unveil potential deficits. In order to evaluate motor activity in tcf4 +/− larvae, the DanioVision system and the EthoVision software were used. The behavioral analysis revealed a decrease in velocity, distance moved and percentage of time moving compared to controls, indicating an impairment of the motor activity. To support the behavioral data, further analyses were conducted to investigate potential alterations in the peripheral and central motor systems, focusing respectively on motoneurons, skeletal muscles and the cerebellum. In 3 dpf tcf4 +/− embryos, motor neurons were labeled by whole mount immunofluorescence using znp-1 antibody and a subsequent analysis revealed a significant reduction in the number of branches in trunk primary motor axons compared to controls. The skeletal muscles were analyzed too using F-actin specific phalloidin staining on 3 dpf tcf4 +/− embryos which unveiled a normal organization of muscle fibers. Analyzing the expression of diverse cerebellar markers, it was possible to investigate specific cell populations of the cerebellum. Whole mount in situ hybridization using aldoca probe allowed the visualization of the Purkinje cells, which showed a preserved organization in 5 days post fertilization (dpf) tcf4 +/− larvae. The anti-vGLUT1/2 antibody labeled glutamatergic neurons revealing an altered phenotype significantly more frequent in 5 dpf tcf4 +/− larvae compared to controls. In addition, the alignment of the zebrafish tcf4 sequences annotated in the major public databases revealed an incongruence at the 5’ end of the transcript. To obtain more reliable information about the tcf4 transcript, required for future experimental applications, a 5’ RACE protocol was performed on RNA extracted from wild-type zebrafish embryos at 48 hours post fertilization (hpf). This approach allowed the identification of the coding sequence up to the translation start site (ATG) of the zebrafish tcf4 transcript, as well as a portion of the 5′ untranslated region (UTR). To conclude, obtained data suggest that in zebrafish tcf4 loss of function is associated with a locomotion impairment, a reduced arborization of primary motor neurons as well as an alteration in the glutamatergic neurons of the cerebellar granule cell layer, suggesting the involvement of both the cerebellum and the motoneurons in the observed behavioral phenotype.

La sindrome di Pitt Hopkins (PTHS) è una malattia rara del neurosviluppo causata da varianti patogenetiche del gene TCF4 che codifica per un fattore di trascrizione bHLH di classe I. Clinicamente la sindrome è caratterizzata da un ampio spettro di segni: tratti facciali atipici, disabilità intellettiva con assenza di linguaggio e un ritardo globale dello sviluppo che coinvolge il sistema respiratorio, gastrointestinale e motorio. I deficit motori comprendono ipotonia muscolare e incoordinazione motoria, la cui origine nello sviluppo non è stata ancora chiarita. Il mio progetto di tesi si è focalizzato quindi sullo studio di questi fenotipi su una linea knock-out di zebrafish per tcf4, precedentemente generata attraverso il sistema CRISPR/Cas9. Le analisi riportate in questa tesi sono state eseguite su embrioni di zebrafish a diversi stadi di sviluppo ed eterozigoti per il knock-out di tcf4, al fine di caratterizzare lo sviluppo del sistema motorio e individuare eventuali deficit durante questo processo. Per valutare l’attività motoria nelle larve tcf4 +/−, sono stati utilizzati il sistema DanioVision e il software EthoVision. L’analisi comportamentale ha evidenziato una riduzione della velocità, della distanza percorsa e della percentuale di tempo in movimento rispetto ai controlli, indicando un deficit nell’attività motoria. Per supportare il dato comportamentale, ulteriori analisi sono state condotte per indagare possibili alterazioni nel sistema motorio periferico e centrale, concentrandosi rispettivamente sui motoneuroni, sui muscoli scheletrici e sul cervelletto. I motoneuroni in embrioni tcf4 +/− a 3 dpf sono stati marcati utilizzando l’anticorpo znp-1 e, una successiva analisi, ha rivelato una riduzione significativa del numero di ramificazioni nei motoneuroni primari del tronco rispetto ai controlli. I muscoli scheletrici sono stati visualizzati in embrioni tcf4 +/− a 3 dpf mediante colorazione con falloidina, evidenziando un’organizzazione delle fibre muscolari preservata. L’analisi dell’espressione di diversi marcatori cerebellari ha reso possibile studiare specifiche sottopopolazioni cellulari del cervelletto. L’ibridazione in situ whole mount con la sonda aldoca ha permesso di visualizzare lo strato cellulare di Purkinje mostrando un’organizzazione preservata in larve tcf4 +/− a 5 giorni post fecondazione (dpf). L’anticorpo anti-vGLUT1/2 ha messo in evidenza i neuroni glutamatergici, rivelando un fenotipo alterato significativamente più frequente in larve tcf4 +/− rispetto ai controlli a 5 dpf. Inoltre, l’allineamento delle sequenze del trascritto di tcf4 di zebrafish annotate nei principali database pubblici ha evidenziato un’incongruenza all’estremità 5’. Per ottenere informazioni più affidabili sul trascritto tcf4, necessarie per future applicazioni sperimentali, è stato eseguito un protocollo di 5’ RACE su RNA estratto da embrioni wild-type di zebrafish a 48 ore post fecondazione (hpf). L’applicazione della tecnica molecolare ha permesso di identificare la sequenza codificante fino al sito di inizio della traduzione (ATG) e una porzione della regione 5’ non tradotta (5’ UTR). In conclusione, i dati ottenuti suggeriscono che la perdita di funzione di tcf4 determini in zebrafish un deficit locomotorio, una ridotta arborizzazione dei motoneuroni primari e un’alterazione dei neuroni glutamatergici del cervelletto e suggerendo il coinvolgimento sia del cervelletto che dei motoneuroni nel fenotipo comportamentale osservato.