• 16S rDNA sequencing
• biodegradation
• biodegradazione
• bioremediation
• biorimediazione
• contaminated soils
• core microbiome
• environmental microbiology
• GC-FID
• hexachlorocyclohexane (HCH)
• marcatori tassonomici
• metabarcoding
• MIBIREM project
• microbiologia ambientale
• microbioma
• microbiome
• suoli contaminati
• taxonomic markers
• α-diversity
• β-diversity.

Nel presente progetto di tesi sono stati analizzati e confrontati microbiomi provenienti da diverse aree geografiche in Europa: Germania, Italia e Spagna I microbiomi isolati sono stati caratterizzati per la loro capacità di degradare l’esaclorocicloesano (HCH), contaminante principale nelle diverse aree di riferimento in quanto ex-siti di produzione dello stesso. A partire dagli anni ’40 del secolo scorso l’isomero γ dell’HCH, nominato Lindano, è stato introdotto come insetticida ad ampio spettro in agricoltura. La sintesi di questa molecola organica comporta contestualmente la produzione degli altri isomeri, denominati α, β, δ. È noto come gli isomeri di HCH siano altamente recalcitranti alle degradazioni e abbiano effetti tossici per gli esseri viventi, quali cancerogenesi, epatotossicità e interferenza sui sistemi endocrini. Ad oggi la produzione di HCH è vietata in Europa, ma restano ancora siti altamente contaminati nelle zone agricole in cui è stato utilizzato, così come nelle zone di produzione. Le tre regioni analizzate presentano diverse storie di contaminazione, nonché una diversità geochimica intrinseca, essendo regioni geograficamente distanti. Poter confrontare microbiomi provenienti da contesti distanti, ma pur sempre in ambiente contaminato da un inquinante altamente persistente come l’HCH, può fornire informazioni riguardo possibili marcatori tassonomici riferibili al contaminante di interesse e perciò caratterizzare quello che potrebbe essere un core-microbiome specifico per questo tipo di suoli con potenziali capacità di trasformazione del contaminante. L’esistenza di marcatori tassonomici prognostici delle capacità intrinseche di una matrice ambientale di degradare uno specifico contaminante è alla base della messa a punto di processi bio-based per il recupero delle stesse. In particolare, nel presente lavoro, un numero significativo di campioni di suolo (10 dalla Germania, 11 dall’Italia e 10 dalla Spagna) sono stati sottoposti ad un protocollo di arricchimento del microbioma. I suoli sono stati utilizzati come inoculo per una coltura in terreno altamente selettivo dove l’HCH era la maggiore fonte di carbonio in presenza di basse concentrazioni di glucosio. Tale processo permette di arricchire microbiomi in grado di resistere alla tossicità dell’HCH e di trasformarlo. Il protocollo di arricchimento si è svolto in parallelo a prove di abbattimento degli isomeri di HCH da parte dei microbiomi a due tempi successivi. Sono state quindi effettuate analisi metagenomiche mediante 16S rDNA metabarcoding, per approfondire la profilazione tassonomica dei microbiomi con maggiori potenzialità degradative e di tutti i terreni utilizzati per la selezione dei microbiomi (31 suoli e 9 microbiomi selezionati,i tre migliori per area geografica).
L’analisi statistica dei dati derivanti dall’analisi del core-microbiome dei microbiomi in grado di degradare l’HCH non ha permesso di individuare marker tassonomici inequivocabili, ma ha portato all’individuazione di generi microbici non ancora descritti come capaci di degradare l’esaclorocicloesano. Il confronto dei dati ottenuti con quelli in letteratura apre all’ipotesi che un microbioma capace di degradare l’HCH, oltre all’attivazione di geni specifici per la degradazione del contaminante (pathway lin), possa attivare pathway degradativi competenti, ma aspecifici ed eventualmente funzionali solo in un contesto di attivazione sinergica di pathway degradativi di un microbioma più che del singolo microrganismo. Questi ultimi devono essere ancora caratterizzati. I microbiomi isolati nel presente lavoro di tesi costituiscono uno strumento importante in questa direzione.

English version:
In this thesis project, microbiomes from different geographical areas in Europe—Germany, Italy, and Spain—were analyzed and compared. The isolated microbiomes were characterized for their ability to degrade hexachlorocyclohexane (HCH), the main contaminant in these areas as former production sites. Since the 1940s, the γ isomer of HCH, known as Lindane, has been used as a broad-spectrum insecticide in agriculture. The synthesis of this organic compound simultaneously produces other isomers, named α, β, and δ. It is well known that HCH isomers are highly resistant to degradation and have toxic effects on living organisms, including carcinogenicity, hepatotoxicity, and endocrine system interference. Although HCH production is now banned in Europe, highly contaminated sites still persist in agricultural areas where it was used, as well as in production zones.
The three analyzed regions exhibit distinct contamination histories and inherent geochemical diversity, being geographically distant areas. Comparing microbiomes from such diverse yet consistently HCH-contaminated environments can provide insights into potential taxonomic markers associated with the contaminant of interest, enabling the characterization of a core microbiome specific to these soils with potential contaminant transformation capabilities. The existence of prognostic taxonomic markers for the intrinsic ability of an environmental matrix to degrade a specific contaminant forms the basis for developing bio-based processes for their recovery.
In this study, a significant number of soil samples (10 from Germany, 11 from Italy, and 10 from Spain) were subjected to a microbiome enrichment protocol. The soils were used as inoculum in highly selective culture media where HCH was the primary carbon source, alongside low concentrations of glucose. This process enriches microbiomes capable of resisting HCH toxicity and transforming it.
The enrichment protocol was conducted in parallel with tests assessing the depletion of HCH isomers by microbiomes at two successive time points. Metagenomic analyses using 16S rDNA metabarcoding were then performed to explore the taxonomic profiling of microbiomes with the greatest degradative potential and the soils used for microbiome selection (31 soils and 9 selected microbiomes, the top three for each geographical area).
The statistical analysis of data derived from the core microbiome analysis of microbiomes capable of degrading HCH did not identify unequivocal taxonomic markers but did highlight microbial genera not previously described as capable of degrading hexachlorocyclohexane. The comparison of the obtained data with the literature suggests the hypothesis that a microbiome capable of degrading HCH may not only activate specific genes for contaminant degradation (lin pathway) but also utilize competent but nonspecific degradative pathways. These pathways may function effectively only within the synergistic activation context of a microbiome’s degradative pathways rather than those of a single microorganism. These mechanisms still require further characterization. The microbiomes isolated in this thesis work represent an important tool in this direction.