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Il virus del Nilo occidentale (West Nile Virus, WNV), appartenente alla famiglia delle Flaviviridae, causa infezioni umane prevalentemente asintomatiche, con una malattia neuroinvasiva che colpisce circa 1 persona ogni 150-200 infette. La diagnosi tradizionale si basa su approcci sierologici, spesso costosi, lenti e soggetti a cross-reattività anticorpale tra Flavivirus, principalmente a causa della proteina dell’envelope E. Inoltre, tali metodi risultano limitati nelle fasi iniziali dell’infezione per l’assenza di anticorpi.

Questo studio di tesi si propone di sviluppare biosensori acustici per dispositivi di diagnostica point-of-care (POCT), utilizzando una microbilancia a cristalli di quarzo con monitoraggio della dissipazione (QCM-D). Il biosensore è stato progettato per rilevare la proteina NS1, una glicoproteina (42 kDa) secreta da cellule infette nel sangue, urina e saliva. La rilevazione si basa sull’immobilizzazione dell’anticorpo anti-NS1 sulla superficie del sensore mediante un adlayer chimico. La QCM-D sfrutta trasduttori piezoelettrici per rilevare variazioni di massa a livello molecolare, misurabili come cambiamenti nella frequenza di risonanza del quarzo.

Uno screening preliminare ha valutato quattro molecole per formare l’adlayer: acido 12-mercaptododecanoico (12-MCA), e polietilenglicole (PEG) di tre pesi molecolari (600, 2100 e 5000 Da). I risultati hanno mostrato una densità molecolare inversamente proporzionale al peso molecolare dell’adlayer, con valori che variano tra 82.5×10²² e 6.8×10²² molecole/m². Successivamente, è stata valutata la proprietà anti-fouling (resistenza all’adsorbimento aspecifico di proteine) di 12-MCA e PEG-2100, testando l’adesione dell’albumina sierica bovina (BSA). Non sono state osservate differenze significative tra gruppi carbossilici attivati (con EDC/NHS) e non attivati.

È stata quindi studiata l’immobilizzazione del biorecettore anti-NS1 su adlayer a base di 12-MCA e PEG-2100. Nel caso di 12-MCA, l’NS1 ha prodotto segnali medi rispettivamente 4 e 15 volte maggiori rispetto alla BSA, per concentrazioni dell’analita pari a 25.0 e 2.5 µg/ml. Per PEG-2100, nella condizione di adlayer non attivato, l’adesione di NS1 era 4.6 volte superiore rispetto alla BSA, rapporto che saliva a 9.1 in presenza del biorecettore legato covalentemente.

Una curva di calibrazione per 12-MCA ha permesso di determinare un limite di rilevazione (LoD) di 39.6 ng/ml. Studi di specificità hanno evidenziato che l’NS1 produce un segnale 15.2 volte maggiore rispetto alla BSA con 12-MCA (interazioni deboli) e 5.8 volte maggiore con PEG-2100 (interazioni covalenti), riducendosi rispettivamente a 8.6 e 3.6 utilizzando un biorecettore aspecifico.

In conclusione, lo studio ha fornito risultati preliminari sulle funzionalizzazioni chimiche applicabili ai biosensori acustici per la rilevazione del WNV. Tuttavia, sono necessari ulteriori approfondimenti sul limite di rilevamento dei sensori basati su PEG-2100 e sulla caratterizzazione chimico-fisica delle superfici. Tali sviluppi potranno ottimizzare il sensore per una futura integrazione in dispositivi diagnostici portatili per la diagnosi precoce del virus.

The West Nile Virus (WNV), belonging to the Flaviviridae family, causes predominantly asymptomatic infections in humans, with neuroinvasive disease affecting approximately 1 in 150–200 cases. Traditional diagnostic methods rely on serological approaches that are often costly, time-consuming, and prone to cross-reactivity among Flavivirus species, mainly due to the envelope E protein. These methods are also limited in early infection stages due to the absence of detectable antibodies.

This thesis aims to develop acoustic biosensors for point-of-care diagnostic devices (POCT) using a quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D). The biosensor is designed to detect the NS1 protein, a glycoprotein (42 kDa) secreted by infected cells into blood, urine, and saliva. Detection relies on immobilizing anti-NS1 antibodies onto the sensor surface via a chemical adlayer. The QCM-D uses piezoelectric transducers to detect molecular-level mass variations, measurable as shifts in the quartz resonance frequency.

A preliminary screening evaluated four molecules for adlayer formation: 12-mercaptododecanoic acid (12-MCA) and polyethylene glycol (PEG) with three molecular weights (600, 2100, and 5000 Da). Results showed that molecular density was inversely proportional to the adlayer’s molecular weight, with values ranging between 82.5×10²² and 6.8×10²² molecules/m². Subsequently, the anti-fouling properties (resistance to nonspecific protein adsorption) of 12-MCA and PEG-2100 were assessed using bovine serum albumin (BSA). No significant differences were observed between activated (EDC/NHS) and non-activated carboxyl groups.

The immobilization of anti-NS1 antibodies on 12-MCA and PEG-2100-based adlayers was studied. For 12-MCA, NS1 produced mean signals 4 and 15 times higher than BSA at analyte concentrations of 25.0 and 2.5 µg/ml, respectively. For PEG-2100, NS1 adhesion was 4.6 times higher than BSA in the non-activated adlayer condition, increasing to 9.1 when the bioreceptor was covalently attached.

A calibration curve for 12-MCA determined a limit of detection (LoD) of 39.6 ng/ml. Specificity studies showed that NS1 produced a signal 15.2 times higher than BSA with 12-MCA (weak interactions) and 5.8 times higher with PEG-2100 (covalent interactions). These ratios decreased to 8.6 and 3.6, respectively, when using a nonspecific bioreceptor.

In conclusion, this study provided preliminary insights into chemical functionalization strategies for acoustic biosensors aimed at WNV detection. However, further investigations into the detection limits of PEG-2100-based sensors and the physicochemical characterization of functionalized surfaces are necessary. These developments will be crucial to optimize the sensor for future integration into portable diagnostic devices for the early detection of WNV infections