• CRISPR-Cas13
• Mieloma Multiplo
• Multiple Myeloma
• NRAS
• siRNA

Il Mieloma Multiplo è la seconda neoplasia ematologica più comune ed è caratterizzata dall'espansione clonale di plasmacellule principalmente nel midollo osseo. A livello genetico, è causato da traslocazioni, soprattutto nel cromosoma 14, e da mutazioni puntiformi all’interno dei geni KRAS e NRAS. Questi geni codificano per GTPasi che fanno parte della via delle MAPK e di PI3K/AKT. Le mutazioni puntiformi determinano l’attivazione costitutiva di tali geni. Le mutazioni di NRAS più frequenti si trovano sul codone 61 e sono missenso (Q61R e Q61K). Molti studi hanno evidenziato l’associazione di queste mutazioni missenso con la resistenza ai trattamenti farmacologici e con la progressione del tumore. Identificare un metodo per inibire l’espressione di tali proteine mutate potrebbe essere una valida strategia per combattere la progressione tumorale. Durante il mio periodo di tesi, ho affrontato due approcci differenti per limitare l’espressione di NRAS mutato: Small Interfering RNA e CRISPR-Cas13. Il primo approccio prevede l’uso di siRNA in grado di legare l’mRNA mutato di NRAS. Questi siRNA sono stati testati su due linee cellulari di Mieloma Multiplo, le JJN3, una linea cellulare eterozigote per la mutazione NRAS Q61K, e le OPM2, una linea cellulare wild type per NRAS. Il secondo approccio si basa sull’utilizzo del sistema CRISPR-Cas13 contro le mutazioni NRAS Q61R e Q61K. Per valutare l’inibizione dell’espressione dell’allele mutato di NRAS sono stati effettuati saggi molecolari quali la Real Time PCR, il Western Blot e l’analisi al citofluorimetro dell’attivazione delle vie di segnale a valle di NRAS mediante l’analisi di pERK e pAKT. Inoltre, grazie a saggi cellulari, come l’analisi della vitalità cellulare tramite il Real-Time Glo, l’analisi della capacità di formazione delle colonie su metilcellulosa e l’analisi dell’attivazione delle Caspasi 3/7, è stato possibile evidenziare il ruolo biologico di NRAS mutato.

Multiple Myeloma is the second most common haematological malignancy and is characterised by the clonal expansion of plasma cells mainly in the bone marrow. At the genetic level, it is caused by translocations, mainly in chromosome 14, and point mutations in KRAS and NRAS genes. These genes encode for GTPases that are part of MAPK and PI3K/AKT pathways. Point mutations result in constitutive activation of these genes. The most frequent NRAS mutations are found at codon 61 and are missense (Q61R and Q61K). Many studies have shown the association of these missense mutations with drug resistance and tumour progression. Identifying a method to inhibit the expression of these mutated proteins could be a viable strategy to combat tumour progression. During my thesis period, I studied two different approaches to limit the expression of mutated NRAS: Small Interfering RNA and CRISPR-Cas13. The first approach involves the use of siRNAs capable of binding mutated NRAS mRNA. These siRNAs were tested on two Multiple Myeloma cell lines, JJN3, a cell line heterozygous for the NRAS Q61K mutation, and OPM2, a wild type cell line for NRAS. The second approach is based on the use of the CRISPR-Cas13 system against the NRAS Q61R and Q61K mutations. To assess the inhibition of the expression of the mutated NRAS allele, molecular assays such as Real Time PCR, Western Blot and cytofluorometer analysis of the activation of NRAS downstream signaling pathways, pERK and pAKT, were performed. In addition, cellular assays such as cell viability analysis by Real-Time Glo, analysis of colony-forming capacity on methylcellulose, and analysis of Caspase 3/7 activation made it possible to highlight the biological role of mutated NRAS.