ETD

• diabete
• EndoCβH1
• esosomi

Il diabete mellito di tipo 1 (Type 1 Diabetes, T1D) è una patologia autoimmune cronica caratterizzata dalla distruzione selettiva delle cellule β pancreatiche, responsabili della produzione di insulina. La progressiva perdita di queste cellule comporta una riduzione che può arrivare fino alla completa o quasi completa perdita dell’insulina endogena, ormone essenziale per il controllo dell’omeostasi glucidica. Questa carenza determina un accumulo di glucosio nel sangue, condizione nota come iperglicemia, che rappresenta il principale fattore patogenetico delle complicanze a lungo termine della malattia.
Le terapie attualmente disponibili per il T1D si basano principalmente sulla somministrazione esogena di insulina, che tuttavia non è in grado di mimare in maniera fisiologica la secrezione dinamica delle cellule β pancreatiche, rendendo complesso il mantenimento di un adeguato controllo glicemico.
In questo contesto, emerge la necessità di sviluppare strategie terapeutiche innovative e più mirate. Gli esosomi, vescicole extracellulari naturalmente secrete da tutte le cellule dell’organismo umano sia in condizioni fisiologiche che patologiche, svolgono un ruolo chiave nella comunicazione intercellulare attraverso il trasferimento di macromolecole biologiche, ovvero principalmente proteine, lipidi, ed acidi nucleici. Numerose evidenze sperimentali hanno dimostrato la loro capacità di interagire con cellule bersaglio, modulandone le vie di segnalazione intracellulare, le funzioni ed il fenotipo. Per questo, gli esosomi rappresentano promettenti nanopiattaforme biologiche per la veicolazione mirata di molecole terapeutiche.
La presente tesi si propone di studiare il potenziale degli esosomi come sistema di delivery selettivo verso le cellule β pancreatiche, con l’obiettivo di sviluppare nuovi approcci terapeutici innovativi e mirati, in grado di ridurre gli effetti off-target su altre popolazioni cellulari.
Il recettore del glucagon-like peptide-1 (GLP1R), altamente espresso sulle cellule β pancreatiche, rappresenta un promettente bersaglio per strategie di delivery mirato. In questo contesto, l’exenatide, un analogo del GLP-1, è stato proposto come elemento di superficie degli esosomi per il targeting delle cellule β. Parallelamente, è stato sviluppato un approccio di marcatura basato sull’ancoraggio di una proteina fluorescente verde farnesilata (GFP-f) alla superficie degli esosomi, che consente una tracciabilità selettiva e accurata delle vescicole dall’isolamento fino all’assorbimento da parte delle cellule bersaglio.
Le cellule HEK293T/17, caratterizzate da un’elevata efficienza di trasfezione e dalla capacità di esprimere efficacemente proteine a partire da DNA plasmidico, sono state trasfettate con il costrutto LAMP2B-exenatide, come elemento di targeting, e con il costrutto GFP-f, come elemento di labelling. Gli esosomi prodotti da queste cellule sono stati isolati mediante cromatografia ad esclusione molecolare (SEC, Size Exclusion Chromatography) e caratterizzati (TRPS, Tunable Resistive Pulse Sensing; WB, Western Blot).
Successivamente, una volta confermata mediante saggio di immunofluorescenza (IF) l’espressione del GLP1R in cellule β pancreatiche umane (EndoC-βH1), queste sono state utilizzate per valutare l’efficienza di internalizzazione degli esosomi mediata dall’interazione tra exenatide e GLP1R, in confronto a cellule di controllo caratterizzate da un’espressione trascurabile del recettore. L’internalizzazione degli esosomi nelle cellule recipienti è stata valutata misurando l’intensità di fluorescenza della GFP, esposta sulla superficie degli esosomi (GFP-f) come elemento di tracking.
I dati ottenuti mostrano una significativa internalizzazione degli esosomi LAMP2B-exenatide nelle cellule EndoC-βH1 rispetto alle cellule di controllo, dimostrando l’efficacia dell’elemento di targeting nel favorire l’uptake selettivo nelle cellule β pancreatiche. Complessivamente, i risultati ottenuti indicano che gli esosomi opportunamente funzionalizzati rappresentano un valido sistema di delivery selettivo verso le cellule β pancreatiche. Ulteriori studi saranno necessari per valutare l’efficienza di internalizzazione della nanopiattaforma biologica sviluppata in modelli avanzati di T1D, con l’obiettivo di sviluppare approcci terapeutici innovativi per il diabete mellito di tipo 1, orientati alla protezione, al recupero funzionale e/o alla modulazione della risposta cellulare delle cellule β pancreatiche.