• apatite biogenica (biogenic apatite)
• coating
• dispositivi ortopedici (orthopedic devices)
• Ionized Jet Deposition
• lega CoCrMo (CoCrMo alloy)
• osteointegrazione (osteointegration)
• scaffold porosi (porous scaffold)

L'osso umano possiede capacità rigenerative intrinseche, ma in alcune situazioni, come gravi lesioni, patologie croniche, difetti congeniti o neoplasie, il tessuto osseo non riesce a rigenerarsi autonomamente, rendendo necessario l'utilizzo di impianti ortopedici. Tuttavia, il successo di questi dispositivi è spesso limitato dalla scarsa osteointegrazione, ovvero dall'incapacità dell'osso di integrarsi efficacemente e a lungo termine con l'impianto. Per affrontare questa problematica, la ricerca si è concentrata sullo sviluppo di scaffold, strutture tridimensionali biomimetiche progettate per replicare le caratteristiche meccaniche, chimiche e biologiche dell'osso naturale. Gli scaffold offrono un supporto per la crescita cellulare, stimolando la rigenerazione ossea e migliorando l'integrazione con i tessuti circostanti. Studi precedenti hanno portato alla realizzazione di strutture porose in lega di Cobalto-Cromo, dimostrando come esse favoriscano l'adesione, la vitalità e la proliferazione cellulare rispetto agli impianti metallici a densità piena. Inoltre, la porosità di questi dispositivi riduce la rigidezza dell'impianto permettendo un trasferimento del carico più uniforme all'osso. La scelta della lega CoCr è stata guidata dalle sue elevate proprietà meccaniche. Tuttavia, questa lega presenta una biocompatibilità inferiore rispetto al titanio, più comunemente utilizzato in ambito biomedicale. Per superare tale limite, il presente lavoro di tesi propone la realizzazione di scaffold porosi con una modifica superficiale ottenuta tramite la deposizione di un rivestimento bioattivo in apatite biogenica. L'obiettivo è valutare la fattibilità e identificare le caratteristiche di questo coating che possano favorire positivamente il processo di osteointegrazione.
Gli scaffold utilizzati in questo studio sono stati realizzati con la tecnica di Additive Manufacturing Selective Laser Melting (SLM) che permette di fondere polveri metalliche strato per strato a partire da un modello CAD.
Gli scaffold prodotti sono stati suddivisi in due tipologie: "pieni" e "porosi", ottenuti dalla ripetizione di una cella cava cubica, per analisi della distribuzione e composizione chimica del coating. Mentre per la caratterizzazione topografica sono stati utilizzati wafer di silicio, scelti per la loro superficie piatta ideale per confronti comparativi, e scaffold in CoCr pieni, con superfici lucidate a specchio e a rugosità naturale per simulare condizioni reali.
Per il rivestimento degli scaffold è stata utilizzata apatite biogenica, ottenuta da diafisi corticali di femore bovino prelevate localmente, deproteinizzate, lavate in etanolo e ridotte in campioni maneggevoli. La deposizione è avvenuta tramite Ionized Jet Deposition (IJD). Il processo ha previsto l'ablazione del target osseo con un fascio elettronico pulsato ad alta energia, generando una piuma di plasma atomico che si è condensata sui substrati, montati su un supporto rotante. Un nastro di carbonio è stato applicato sui substrati per definire una zona di interfaccia tra le aree rivestite e non rivestite.
La caratterizzazione dei rivestimenti è stata effettuata utilizzando una combinazione di tecniche analitiche avanzate. La microscopia elettronica a scansione (SEM) e la spettroscopia a dispersione di energia (EDS) hanno permesso di valutare la distribuzione e la struttura del rivestimento. La microscopia a forza atomica (AFM) ha analizzato la topografia superficiale e lo spessore, mentre la spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier (FTIR) ha fornito dati sulla composizione chimica e il grado di cristallinità. Sono stati inoltre esaminati la bagnabilità e la capacità del rivestimento di penetrare nei substrati di CoCr porosi.
L'analisi SEM-EDS è stata utilizzata per esaminare i rivestimenti depositati su substrati di Cobalto-Cromo con l'obiettivo di individuare i parametri più adeguati per ottenere una deposizione uniforme.
Successivamente, grazie all'introduzione di un tempo di shutter mediante un otturatore, è stata condotta un'analisi AFM per studiare l'influenza di quattro diversi tempi di deposizione (15, 30, 45 e 60 minuti) sulla qualità del rivestimento. Questa fase ha coinvolto substrati di silicio e Cromo-Cobalto lucidati a specchio, su cui sono state effettuate misure specifiche. Le scansioni panoramiche hanno permesso di valutare la distribuzione del rivestimento, la rugosità è stata misurata tramite il valore RMS. Lo spessore del rivestimento, invece, è stato determinato sia lungo un profilo delle immagini AFM sia attraverso un tool MATLAB sviluppato appositamente che ha calcolato la distanza media tra la superficie rivestita e quella non rivestita.
L'analisi chimica è stata condotta mediante spettroscopia FTIR-ATR, acquisendo spettri dalle stesse aree esaminate in AFM, per identificare le sostanze presenti. La bagnabilità dei substrati è stata valutata con il software ImageJ, misurando l'angolo di contatto di gocce d'acqua deionizzata su substrati privi di porosità. Inoltre, per i substrati porosi è stata valutata la capacità del coating di penetrare anche nei pori, un aspetto cruciale per favorire la proliferazione cellulare. I i campioni sono stati incapsulati in PMMA, sezionati e osservati al microscopio.
Le analisi SEM sui substrati di Cobalto-Cromo rivelano aggregati globulari distribuiti in modo irregolare, lasciando ipotizzare un rivestimento disomogeneo. Tuttavia, gli spettri EDS rilevano una significativa presenza di Cr e Co, indicando che gli agglomerati osservati potrebbero derivare da un processo di sinterizzazione incompleto. Imoltre, il ridotto spessore del rivestimento potrebbe permettere al fascio di elettroni del SEM di penetrare fino al substrato metallico sottostante. L'analisi EDS ha inoltre rilevato elementi come Magnesio e Sodio, indicativi di un'apatite multi-sostituita. Il rapporto Ca/P segnala un eccesso di calcio, che potrebbe ridurre la solubilità del rivestimento in ambienti fisiologici, limitandone la capacità di rilasciare ioni utili alla mineralizzazione ossea.
Dopo aver ottimizzato la deposizione, è stata condotta un’analisi AFM. I risultati hanno mostrato che aumentando il tempo di deposizione fino a 60 minuti, si ottiene una copertura più uniforme, riducendo le discontinuità e aumentando le dimensioni degli agglomerati. Sui substrati di CoCr lucidato a specchio, i risultati sono stati simili a quelli ottenuti sui substrati di silicio. Mentre, nei substrati a rugosità naturale, si è osservato un accumulo preferenziale di materiale sulle asperità. Questo substrato, con maggiore rugosità rispetto al silicio e al CoCr lucidato, è vantaggioso per l'osteointegrazione poiché può favorire il contatto con le cellule osteogeniche.
Il calcolo dello spessore del rivestimento, che varia tra 60 e 800 nm a seconda del tempo di deposizione, è stato eseguito tramite il software Gwyddion, analizzando le interfacce tra le aree rivestite e non rivestite dei substrati. I valori medi ottenuti con Matlab analizzando l'intera superficie di interesse hanno confermato che il tempo ottimale di deposizione è di 60 minuti, in quanto garantisce uno spessore sufficiente a ridurre l'esposizione del substrato metallico.
Gli spettri FT-IR hanno confermato che i rivestimenti sono composti da apatite biogenica, caratterizzata dai picchi di assorbimento di carbonati e fosfati. Tuttavia, come evince dalle bande ampie e poco definite rispetto a quelle del target osseo (nero), un aumento del tempo di deposizione ha ridotto la cristallinità del rivestimento, il che potrebbe renderlo meno resistente pur mantenendo una buona bioattività. In termini di bagnabilità, si è osservato un miglioramento significativo con l'aumento del tempo di deposizione. I substrati rivestiti hanno mostrato angoli di contatto inferiore rispetto ai campioni di riferimento non rivestiti. L’idrofilicità è risultata direttamente proporzionale alla rugosità superficiale dei substrati analizzati, suggerendo che superfici più ruvide favoriscono una migliore interazione con i fluidi biologici.
Infine, l'analisi delle sezioni trasversali ha evidenziato un'autofluorescenza gialla associata al coating, particolarmente intensa sulle superfici esterne degli scaffold e meno marcata nei pori. Questo è attribuibile alla geometria complessa dello scaffold e alla direzionalità del processo IJD e sottolinea la necessità di integrare tecniche complementari per migliorare l'uniformità della deposizione. La colorazione con Rosso Alizarina non ha fornito dettagli aggiuntivi, probabilmente a causa dello spessore sottile del rivestimento.
I risultati ottenuti sono significativi e contribuiscono a sviluppi futuri che prevedono l'esecuzione di test di adesione per valutare la resistenza meccanica del rivestimento e trattamenti post-deposizione, come la ricottura, per migliorare la stabilità e l'idrofilicità del rivestimento. Inoltre, saranno condotti studi in vitro con cellule di derivazione ossea per confermare la capacità del rivestimento di favorire l'osteointegrazione. Un'altra direzione di ricerca riguarda l'applicazione del rivestimento su substrati in titanio.
In conclusione, questo lavoro analizza le proprietà del sistema combinato scaffold-coating per valutarne la fattibilità e sviluppare rivestimenti più efficaci e durevoli che possano favorire un'osteointegrazione ottimale e migliorare le prestazioni cliniche degli impianti.

Human bone has intrinsic regenerative capabilities, but in certain situations, such as severe injuries, chronic diseases, congenital defects, or neoplasms, bone tissue is unable to regenerate autonomously, making the use of orthopedic implants necessary. However, the success of these devices is often limited by poor osteointegration, which refers to the inability of the bone to integrate effectively and long-term with the implant. To address this issue, research has focused on the development of scaffolds, three-dimensional biomimetic structures designed to replicate the mechanical, chemical, and biological characteristics of natural bone. Scaffolds provide support for cell growth, stimulate bone regeneration, and enhance integration with surrounding tissues.
Previous studies have led to the development of porous structures made of Cobalt-Chromium alloy, demonstrating that these structures promote cell adhesion, vitality, and proliferation compared to full-density metallic implants. Furthermore, the porosity of these devices reduces the stiffness of the implant, allowing for a more uniform load transfer to the bone. The choice of the CoCr alloy was driven by its excellent mechanical properties. However, this alloy exhibits lower biocompatibility compared to titanium, which is more commonly used in biomedical applications. To overcome this limitation, this thesis proposes the production of porous scaffolds with a surface modification obtained through the deposition of a bioactive biogenic apatite coating. The objective is to assess feasibility and identify the coating characteristics that can positively influence the osteointegration process.
The scaffolds used in this study were manufactured using the Additive Manufacturing Selective Laser Melting (SLM) technique, which allows for layer-by-layer fusion of metal powders based on a CAD model. The scaffolds produced were divided into two types: "solid" and "porous," obtained by repeating a hollow cubic cell, to analyze the distribution and chemical composition of the coating. For topographical characterization, silicon wafers with flat surfaces were used for comparative analysis, along with CoCr solid scaffolds with mirror-polished and naturally rough surfaces to simulate real conditions. For the coating of the scaffolds, biogenic apatite was used, obtained from cortical diaphyses of locally sourced bovine femurs. These were deproteinized, washed with ethanol, and reduced into manageable samples. The deposition was carried out using Ionized Jet Deposition (IJD). The process involved ablating the bone target with a high-energy pulsed electron beam, generating a plume of atomic plasma that condensed onto the substrates mounted on a rotating holder. A carbon tape was applied to the substrates to define an interface zone between coated and uncoated areas.
The characterization of the coatings was performed using a combination of advanced analytical techniques. Scanning electron microscopy (SEM) and energy-dispersive spectroscopy (EDS) were used to evaluate the distribution and structure of the coating. Atomic force microscopy (AFM) analyzed the surface topography and thickness, while Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR) provided data on the chemical composition and degree of crystallinity. Wettability and the coating’s ability to penetrate into porous CoCr substrates were also examined.
SEM-EDS analysis was employed to study the coatings deposited on cobalt-chromium substrates to identify optimal parameters for achieving uniform deposition. Subsequently, with the introduction of a shutter time using a mechanical shutter, AFM analysis was conducted to investigate the influence of four different deposition times (15, 30, 45, and 60 minutes) on the coating quality. This phase involved silicon and mirror-polished cobalt-chromium substrates, where specific measurements were performed. Panoramic scans evaluated the coating distribution, roughness was measured via RMS values, and coating thickness was determined both along a profile in AFM images and through a custom MATLAB tool that calculated the average distance between the coated and uncoated surfaces.
Chemical analysis was conducted using FTIR-ATR spectroscopy, acquiring spectra from the same areas examined with AFM to identify the substances present. Wettability was evaluated using ImageJ software by measuring the contact angle of deionized water droplets on non-porous substrates. For porous substrates, the ability of the coating to penetrate into the pores—a critical aspect for promoting cell proliferation—was assessed. Samples were encapsulated in PMMA, sectioned, and observed under a microscope.
SEM analysis of the cobalt-chromium substrates revealed irregularly distributed globular aggregates, suggesting a non-uniform coating. However, EDS spectra detected significant amounts of Cr and Co, indicating that the observed agglomerates might result from incomplete sintering. Additionally, the thin coating might allow the SEM electron beam to penetrate to the underlying metal substrate. EDS also identified elements such as magnesium and sodium, indicative of a multi-substituted apatite. The Ca/P ratio indicated an excess of calcium, which could reduce the coating's solubility in physiological environments, limiting its ability to release ions beneficial for bone mineralization.
Following deposition optimization, AFM analysis was conducted. Results showed that increasing the deposition time up to 60 minutes achieved more uniform coverage, reducing discontinuities and increasing the size of agglomerates. On mirror-polished CoCr substrates, the results were similar to those on silicon substrates. On naturally rough substrates, preferential material accumulation on asperities was observed. This substrate, with greater roughness than silicon and polished CoCr, is advantageous for osteointegration as it can promote contact with osteogenic cells.
The coating thickness, varying between 60 and 800 nm depending on deposition time, was calculated using Gwyddion software by analyzing the interfaces between coated and uncoated substrate areas. The average values obtained with MATLAB by analyzing the entire surface of interest confirmed that the optimal deposition time is 60 minutes, as it ensures sufficient thickness to reduce the exposure of the metal substrate.
FTIR spectra confirmed that the coatings are composed of biogenic apatite, characterized by absorption peaks of carbonates and phosphates. However, as evidenced by the broader and less defined bands compared to those of the bone target (black), increasing deposition time reduced the coating's crystallinity, which might make it less resistant while maintaining good bioactivity. In terms of wettability, a significant improvement was observed with increasing deposition time. Coated substrates exhibited lower contact angles than uncoated reference samples. Hydrophilicity was directly proportional to the surface roughness of the analyzed substrates, suggesting that rougher surfaces enhance interaction with biological fluids.
Finally, cross-sectional analysis revealed a yellow autofluorescence associated with the coating, particularly intense on the external surfaces of the scaffolds and less pronounced in the pores. This was attributed to the scaffold's complex geometry and the directional nature of the IJD process, highlighting the need to integrate complementary techniques to improve deposition uniformity. Staining with Alizarin Red did not provide additional details, likely due to the thin coating thickness.
The obtained results are significant and contribute to future developments, including adhesion tests to evaluate the mechanical strength of the coating and post-deposition treatments, such as annealing, to improve coating stability and hydrophilicity. Additionally, in vitro studies with bone-derived cells will be conducted to confirm the coating's ability to promote osteointegration. Another research direction involves applying the coating to titanium substrates.
In conclusion, this work analyzes the properties of the scaffold-coating system to assess its feasibility and develop more effective and durable coatings that can promote optimal osteointegration and improve the clinical performance of implants.