ETD

• A549
• AKR
• AKR1B10
• HNE
• MCF-7
• ROS
• stress ossidativo

L’enzima umano monomerico AKR1B10 è una ossido-reduttasi citosolica NADPH dipendente che
metabolizza una varietà di composti endogeni. Appartenente alla super famiglia delle Aldo-Keto
reduttasi (AKR), questo enzima catalizza reazioni di ossidoriduzione nei confronti di molti substrati
carbonilici. L’enzima è altamente espresso nei tumori solidi di molti tessuti, tra cui polmoni e
mammella ed essendo coinvolto nella proliferazione di vari tipi cellulari, ha ricevuto notevole
interesse come biomarcatore. La rilevazione dell’enzima nel siero di pazienti oncologici, riportata in
letteratura, supporta l’ipotesi di un suo possibile impiego come biomarcatore tumorale. L’AKR1B10
è coinvolto nella crescita e proliferazione cellulare tramite eliminazione di carbonili citotossici quali
il 4-idrossi-2,3nonenale (HNE) derivante dalla perossidazione lipidica e nella chemioresistenza nei
confronti di specifici agenti antitumorali contenenti gruppi carbonilici come la doxorubicina, la quale
viene convertita dall’enzima in doxorubicinolo, un metabolita meno attivo dal punto di vista tumorale.
Un’espressione elevata dell’enzima è associata alla resistenza alla doxorubicina riscontrata in vari
tipi di cancro, tra cui quello alla mammella. La presenza di questo enzima si inserisce in un contesto
cellulare alterato che è caratterizzato da un aumento dello stress ossidativo. Le cellule degli organismi
aerobi limitano i danni indotti da stress ossidativo tramite vari sistemi di difesa antiossidanti che
agiscono prevenendo gli effetti negativi delle specie reattive dell’ossigeno (ROS), permettendo il
mantenimento dello stato redox cellulare. Il più noto meccanismo di controllo del metabolismo redox
cellulare è caratterizzato dal glutatione (gammaglutammil-cisteinil-glicina), il tiolo avente l’attività
antiossidante più abbondante del sistema cellulare (concentrazione millimolare).
L’enzima AKR1B10 presenta residui di cisteina, come la Cys299, suscettibili di ossidazione da parte
del glutatione con conseguente alterazione della funzionalità della proteina e questo meccanismo è
ascrivibile a una modulazione dell’enzima da parte della cellula in base a cambiamenti di condizioni
redox.
La mia tesi ha come scopo la valutazione dell’effetto della glutationilazione sull’attività enzimatica
di AKR1B10: in particolare è stato valutato l’effetto indotto del glutatione in un contesto cellulare in
cui coesistono forma ridotta e ossidata del glutatione stesso, misurando l’attività di AKR1B10 in
presenza di rapporti variabili GSH/GSSG e quindi del potenziale redox del glutatione in presenza del
substrato HNE. In questo contesto i rapporti GSH/GSSG rappresentano una forma semplificata del
metabolismo cellulare in cui è stato utilizzato l’HNE come substrato fisiologico.
L'attività di AKR1B10 è stata inoltre valutata utilizzando come substrato la doxorubicina, un farmaco
ampiamente in uso nel trattamento del carcinoma mammario. Per questo motivo è stato preso in
considerazione l’impatto della glutationilazione anche nei confronti di questo agente chemioterapico.
Come modello cellulare di carcinoma mammario di riferimento è stata utilizzata la linea MCF7 sulla
quale è stata inizialmente valutata l’espressione basale dell’enzima.
L’effetto della doxorubicina è stato quindi considerato in termini di citotossicità e di incremento dei
livelli di ROS intracellulari. La risposta di questa linea allo stress ossidativo, mediata da AKR1B10
è stata infine osservata a seguito di trattamento con HNE.