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Tesi etd-12182014-232105


Tipo di tesi
Tesi di laurea specialistica LC5
Autore
ALI', ALESSANDRA
URN
etd-12182014-232105
Titolo
VALUTAZIONE DEGLI EFFETTI ANTI-TUMORALI DI UN NUOVO INIBITORE MULTI-TARGET PDK1/GSK3/CHK1 SU LINEE CELLULARI CHEMIORESISTENTI DI GLIOBLASTOMA UMANO
Struttura
FARMACIA
Corso di studi
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Commissione
relatore Dott.ssa Martelli, Alma
correlatore Dott.ssa Rapposelli, Simona
relatore Prof. Calderone, Vincenzo
Parole chiave
  • TMZ
  • PDK1
  • pathway PI3K/Akt/mTOR
  • Oxid-2
  • glioblastoma
  • GSK3
  • CHK1
  • ANGM-CSS
  • U118-MG
Data inizio appello
21/01/2015;
Disponibilità
parziale
Riassunto analitico
Il glioblastoma (astrocitoma di IV grado WHO) è il più comune glioma del sistema nervoso centrale negli adulti ed è essenzialmente incurabile. I pazienti con glioblastoma hanno una sopravvivenza media di 15 mesi e nonostante i miglioramenti ottenuti attraverso una combinazione di neuro-resezione, chemioterapia e radioterapia, le aspettative di vita del paziente rimangono invariate.
A livello cellulare, la crescita, la sopravvivenza, la proliferazione e l'apoptosi sono processi regolati dal pathway di segnalazione intracellulare PI3K/Akt/mTOR e negli ultimi anni è diventata evidente la connessione di tale via con i processi di crescita e proliferazione delle cellule tumorali. Pertanto, è fondamentale sviluppare un'efficace strategia farmacologica focalizzata sull’inibizione delle protein-chinasi coinvolte in tali pathway.
Per questo studio sono state utilizzate due linee di glioblastoma umano: le U118-MG e le ANGM-CSS (ATCC, Manassas, VA, USA; IRCCS-CASA, Sollievo Della Sofferenza Hospital, San Giovanni Rotondo, FG, Italy) che sono linee tumorali chemioresistenti e quindi particolarmente utili per studiare la patologia molecolare del glioblastoma multiforme e soprattutto valutare l'efficacia di nuovi farmaci terapeutici in vitro.
In una prima fase, è stato valutato l'andamento della vitalità e della proliferazione cellulari nell’arco delle 144 h di entrambe le linee a seguito dell'incubazione con concentrazioni crescenti del composto di nuova sintesi Oxid-2, molecola in fase di sperimentazione, sintetizzata nei laboratori del Dipartimento di Farmacia dell’Università di Pisa, dotata di meccanismo inibitorio “multi-target” su più livelli della via di segnalazione ed in particolare sulle chinasi PDK1, GSK3β e CHK1. Le cellule sono state portate all'80% della confluenza in fiasca utilizzando l'appropriato mezzo di coltura DMEM:HAM F12 (1:1) (Sigma-Aldrich®); successivamente, 24 h prima dell'inizio dell'esperimento, sono state staccate dalla fiasca, contate e seminate in piastre multi-well da 96 pozzetti in modo da farle ben aderire al fondo del pozzetto. A seguito dell'incubazione con Oxid-2, la vitalità è stata quantificata a 72, 96, 120 e 144 h tramite saggio colorimetrico con WST-1 e successiva lettura con il lettore multipiastra EnSpire® PerkinElmer. I dati ottenuti dai vari esperimenti hanno evidenziato una risposta anti-proliferativa concentrazione-dipendente al trattamento con Oxid-2, in particolare per la linea cellulare ANGM-CSS che è risultata più sensibile. Nella seconda fase, si è quindi scelto di utilizzare la linea delle ANGM-CSS per un trattamento combinato di Oxid-2 e di temozolomide (TMZ), farmaco antitumorale alchilante già in commercio e di elezione nel trattamento del glioblastoma, per verificarne un’eventuale sinergia. E' stato eseguito, quindi, lo stesso protocollo per la crescita, la piastratura e l'acquisizione dei dati utilizzato per la prima fase. Sulla base dei dati ottenuti nella prima fase dello studio, sono state individuate una tempistica (120 h) e due diverse concentrazioni di Oxid-2 (10 e 20 μM, concentrazioni intorno all’GI50), da associare con il chemioterapico TMZ 100 μM.
Il dato che emerge dalla seconda parte di tale lavoro sperimentale è che nonostante TMZ sia stata utilizzata ad una concentrazione considerevole, non ha prodotto effetti significativi sulla proliferazione delle ANGM-CSS. Invece, il nuovo derivato di sintesi, Oxid-2 (10-20μM), in linea con quanto osservato negli studi di proliferazione, utilizzato singolarmente ed a concentrazioni più basse rispetto a quella scelta per TMZ, ha determinato una considerevole attività inibitoria sulla proliferazione cellulare. Infine, la co-somministrazione di TMZ ed Oxid-2 non ha portato ad evidenziare alcun effetto additivo, né sinergico dell’attività anti-proliferativa e gli effetti osservati sono del tutto riconducibili a quelli prodotti da Oxid-2 da solo.
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