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Tesi etd-11092004-180738


Tipo di tesi
Tesi di laurea vecchio ordinamento
Autore
Amat, Pietro
URN
etd-11092004-180738
Titolo
Proprieta' elettroniche e strutturali del cromoforo di asCP
Struttura
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
CHIMICA
Commissione
relatore Dott. Tozzini, Valentina
relatore Prof. Persico, Maurizio
Parole chiave
  • asCP
  • GFP
  • fluorescenza
  • cromoforo
Data inizio appello
25/11/2004;
Disponibilità
parziale
Data di rilascio
2044-11-25
Riassunto analitico
La Proteina Verde Fluorescente (Green Fluorescent Protein, GFP) venne estratta dalla medusa Aequorea Victoria e purificata per la prima volta nel 1962. Pochi anni dopo vennero caratterizzate le sue proprieta' ottiche, uniche all'interno della classe delle proteine foto-attive, quali la capacita' di convertire luce dal blu al verde e soprattutto la fluorescenza intrinseca. Il suo utilizzo nelle biotecnologie si sviluppo' a partire dagli anni '90, quando il suo gene venne clonato ed espresso in organismi eterologhi. La proteina infatti si ripiega da sola nella sua corretta struttura secondaria e terziaria. Essa inoltre puo' essere fusa con tecniche di ingegneria genetica ad altre proteine senza alterarne significativamente la funzionalita', costituendo cosi' un marcatore quasi ideale per il monitoraggio del movimento di proteine in cellule viventi con tecniche di microscopia a fluorescenza. Negli ultimi anni si e' scoperto che la GFP appartiene ad una vasta famiglia di proteine imparentate dal punto di vista evoluzionistico e condivise da diverse specie marine dalle meduse ai coralli, agli anemoni di mare, la cui funzione ancestrale potrebbe essere la fotoprotezione (assorbimento di radiazioni ad alta energiaUVe riemissione nel visibile). La proteina AsCP, tema dello studio di questa tesi, e' stata di recente estratta da un anemone di mare, Anemonia Sulcata ed appartiene alla stessa famiglia di proteine della GFP. AsCP, finora poco studiata, presenta proprieta' particolari. Il suo spettro di assorbimento e' notevolmente spostato verso il rosso e piu' strutturato di quello di altre GFP; la proteina puo' passare dalla forma non fluorescente alla forma fluorescente (kindling) e viceversa, tramite illuminazione rispettivamente nel verde e nel blu; le forme non fluorescente e fluorescente possono inoltre essere stabilizzate con specifiche mutazioni. Tutto questo indica una potenziale versatilita' di asCP nell'utilizzo biotecnologico. Tuttavia si conosce ancora poco a proposito della struttura che il cromoforo assume nei vari stati fotoattivi. Come nelle altre GFP, il cromoforo di AsCP si forma autocataliticamente tramite ciclizzazione di tre amminoacidi consecutivi durante il ripiegamento della proteina. La struttura della proteina non e' stata risolta al livello atomico, tuttavia esistono indicazioni sperimentali per un processo di ciclizzazione diverso dalla GFP. Sulla base dei dati sperimentali e' stata quindi individuata per il cromoforo una struttura diversa da quella del cromoforo delle GFP. Nella presente tesi si indagano le proprieta' strutturali, elettroniche e vibrazionali del cromoforo di AsCP. Gli stati elettronici fondamentali ed eccitati delle diverse possibili forme di protonazione del cromoforo verranno studiati e le energie di eccitazione stimate. Lo scopo e' assegnare la struttura e le forme di protonazione del cromoforo tramite un confronto tra energie calcolate e energie di assorbimento osservate nella proteina in forma nativa e denaturata. Tutti i calcoli sul cromoforo sono ab initio. Le ottimizzazioni delle geometrie dei vari stati di protonazione sono effettuate con la Teoria del Funzionale di Densita' (con i programmi CPMD, Gaussian), mentre le energie sono calcolate in due modi diversi: secondo la Teoria del Funzionale di Densita' dipendente dal tempo (TD-DFT) in risposta lineare (con i programmi ADF e CPMD) e con metodi quanto-chimici CASSCF e perturbativi (con i programmi Gamess e Dalton) in modo da poter effettuare un dettagliato confronto.
<b>Dall'insieme dei risultati computazionali viene formulata un'ipotesi di attribuzione della struttura e dello stato di protonazione del cromoforo di asCP denaturata, in soluzione acquosa, e di asCP nativa. Si mostra come questa attribuzione rende compatibili i dati teorici ed i dati sperimentali.</b>
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