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Tesi etd-11042011-173341


Thesis type
Tesi di specializzazione
Author
FRATI, RITA SEPALI MARIA
URN
etd-11042011-173341
Title
CLM94, un inibitore di nuova sintesi attivo sulla proliferazione endoteliale e tumorale in vitro e in vivo
Struttura
MEDICINA E CHIRURGIA
Corso di studi
FARMACOLOGIA
Commissione
relatore Prof. Bocci, Guido
Parole chiave
  • Nessuna parola chiave trovata
Data inizio appello
22/11/2011;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
Le tirosin-chinasi sono enzimi che regolano processi cellulari, quali la proliferazione e la differenziazione cellulare, e possono essere coinvolti nel processo di oncogenesi, poiché catalizzano la fosforilazione dei residui di tirosina di alcuni recettori cellulari, tra cui EGFR, VEGFR-1 e 2 e RET. EGFR è un recettore cellulare transmembrana coinvolto nei normali processi di proliferazione, sopravvivenza, adesione, migrazione e differenziazione cellulare, la cui sovraespressione o mutazione genica può portare all’oncogenesi ed è infatti presente in numerose forme tumorali, quali il carcinoma polmonare non a piccole cellule del polmone (NSCLC-non small lung cell cancer). I recettori VEGFRs ed i relativi membri della famiglia del fattore di crescita endoteliale VEGF, invece, sono le proteine che regolano l’angiogenesi normale e patologica. Infine, l’oncogene RET è coinvolto nello sviluppo del cancro alla midollare della tiroide, MTC. L’attivazione della linea germinale di RET e le mutazioni somatiche sono state identificate come la prima causa di MTC ereditario e sporadico.
Le molecole inibitrici le tirosin-chinasi risultano, quindi, avere un ruolo promettente nel trattamento dell’oncogenesi e dell’angiogenesi patologica, in quanto determinano l’inibizione della trasmissione del segnale mitogeno intracellulare, agendo sulla fosforilazione dei residui di tirosina associati ai recettori, quali VEGFR ed EGFR.
L’interesse dell’odierna ricerca oncologica si è, pertanto, rivolto alla sintesi di nuove molecole inibenti le TK associate ai diversi recettori dei fattori di crescita, in modo da agire su diverse vie di trasmissione del segnale contemporaneamente. In particolare, i laboratori della Facoltà di Farmacia dell’Università di Pisa hanno recentemente intrapreso la sintesi di nuovi composti appartenenti agli inibitori delle tirosin-chinasi. Tra questi vi sono i derivati a nucleo pirazolo [3,4-d] pirimidinico, con sostituenti sulle posizioni 2 e 4 dell’etanolo, e derivati saccarinici.
Studi preliminari di inibizione enzimatica in vitro delle TK associate a EGFR e VEGFR hanno messo in evidenza alcuni composti, tra le pirazolo-pirimidine e tra i derivati saccarinici, particolarmente promettenti.
Obiettivo primario del presente studio è stato quello di effettuare uno screening di efficacia farmacologica in vitro dei composti sintetizzati -CLM3, CLM24, CLM29, CLM30, CLM32 e CLM46 tra i derivati pirazolo-pirimidinici e CLM13, CLM34 e CLM94 tra i derivati saccarinici- su cellule tumorali polmonari umane (A549), esprimenti il recettore EGFR, su cellule tumorali tiroidee (8305C), esprimenti il recettore RET, e su cellule endoteliali microvascolari umane (HMVEC-d), esprimenti il recettore VEGFR, nell’intento di valutare una possibile attività antitumorale e antiangiogenica. Tra i farmaci testati, abbiamo focalizzato l’attenzione sul composto CLM94, il derivato saccarinico che ha dimostrato un’efficacia farmacologica significativa sulla linea cellulare 8305C, cellulare tumorali indifferenziate tiroidee con componente papillare, tumore per il quale non esistono ancora terapie chemioterapiche specifiche.
Obiettivo secondario dello studio è stato, poi, quello di dimostrare l’effetto antiproliferativo di CLM94 in vitro sulla linea tumorale tiroidea (8305C) e sulla linea cellulare endoteliale microvascolare (HMVEC-d) e di studiare un eventuale meccanismo d’azione del composto valutando la fosforilazione dei recettori RET nelle cellule 8305C e VEGFR e EGFR nelle cellule HMVEC-d. In seguito sono stati effettuati studi con lo scopo di dimostrare l’effetto antitumorale ed antiangiogenico di CLM94 in vivo in xenotrapianti di cellule AF in assenza di tossicità.
L’attività antiproliferativa di CLM94 in vitro sulla linea cellulare 8305C e HMVEC-d, come anche i livelli di fosforilazione dei recettori RET, EGFR e VEGFR-2 dopo 72 h di trattamento sono stati misurati attraverso kit ELISA. Dai risultati ottenuti, CLM94 ha dimostrato un forte effetto antiproliferativo con una IC50, ovvero una concentrazione inibente il 50% delle cellule, di 25,80 ± 7,99 μM sulle cellule tumorali 8305C e di 1,60
± 1,11 μM sulle cellule endoteliali HMVEC-d, dopo 72 h di trattamento. Inoltre, anche i livelli di fosforilazione dei recettori RET, EGFR e VEGFR-2 diminuiscono significativamente quando trattati con CLM94.
L’effetto antitumorale di CLM94 in vivo su topi xenotrapiantati con cellule AF è stato dimostrato misurando il volume delle masse tumorali dei topi trattati rispetto agli animali del gruppo di controllo, in assenza di tossicità. Dai dati ottenuti risulta che il volume delle masse tumorali nei topi trattati con CLM94 è significativamente ridotto rispetto a quello nei topi trattati con il solo veicolo (2013,2 ± 577,8 mm3 vs 826,5 ± 228,6 mm3, rispettivamente; P < 0,05). L’effetto antiangiogenico di CLM94 in vivo, invece, è stato dimostrato considerando l’immunoreattività per la proteina VEGF-A negli animali trattati rispetto ai topi del gruppo di controllo. I risultati hanno mostrato un’importante diminuzione di sintesi della proteina VEGF-A da parte delle cellule tumorali nei topi trattati con CLM94 rispetto a quelli trattati con soluzione salina (43,3 ± 5,3 vs 76,7 ± 10,3, % rispettivamente; P < 0,05), con conseguente aumento della percentuale di necrosi delle cellule tumorali nei topi trattati rispetto ai controlli (58,3 ± 7,6 vs 33,3 ± 5,2, % rispettivamente; P < 0,05).
In conclusione, il composto saccarinico CLM94 ha mostrato una significativa attività antiproliferativa, antitumorale ed antiangiogenica in vitro ed in vivo. In particolare CLM94, inibendo le tirosin-chinasi associate ai recettori RET, EGFR e VEGFR, blocca la trasduzione del segnale e, quindi, la proliferazione cellulare tumorale, per cui sembra essere una molecola con promettenti proprietà per il trattamento di diverse forme tumorali, quali anche il tumore anaplastico della tiroide, aprendo la strada a nuovi studi clinici.
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