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Tesi etd-10132016-101953


Thesis type
Tesi di laurea magistrale
Author
FLORIO, FRANCESCO ELIA
URN
etd-10132016-101953
Title
Propagazione in vitro via embriogenesi somatica di Iris pallida Lam. (Giaggiolo)
Struttura
SCIENZE AGRARIE, ALIMENTARI E AGRO-AMBIENTALI
Corso di studi
PRODUZIONI AGROALIMENTARI E GESTIONE DEGLI AGROECOSISTEMI
Commissione
relatore Prof. Malorgio, Fernando
correlatore Prof.ssa Mensuali, Anna
tutor Dott.ssa Lucchesini, Mariella
Parole chiave
  • Toscana
  • colture in vitro
  • Iris pallida
  • HPLC
  • citofluorimetria
  • istologia vegetale
  • giaggiolo
  • embriogenesi
  • micropropagazione
Data inizio appello
12/12/2016;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
Il genere Iris è il più grande presente all’interno delle Iridaceae, raggruppando nel suo insieme più di 300 specie di piante erbacee. Il genere Iris, originario del Giappone e dell’areale mediterraneo, presenta un notevole sviluppo e una localizzazione sudequatoriale, ma è presente su tutto il globo per la diffusione operata dall’uomo. Alcune specie d’Iris, quali Iris pallida, l’Iris germanica ed Iris florentina sono indicate con il nome di Giaggioli. L’I. pallida viene coltivata con il fine di ottenere oli essenziali, comunemente indicate con il nome di ‘‘profumo di violetta’’, apprezzati e ricercati dalle industrie profumiere della Provenza. Questa preziosa essenza viene sintetizzata nei rizomi, per semplice degradazione ossidativa degli iridali, i precursori degli ironi (composti chetonici responsabili del profumo). Gli ironi non sono presenti nei rizomi al momento della raccolta: il processo biochimico che porta alla loro formazione è estremamente lento, tanto che quantità accettabili di ironi si accumulano solo dopo un periodo di stagionatura che varia da tre a quattro anni. I rizomi ottenuti sono in seguito sottoposti a particolari processi chimici che consentono di concentrare per gradi l’essenza profumata fino ad ottenere l’assoluta d’iris, una sostanza contenente l’80% di ironi. Il valore dell’assoluta di Iris si aggira intorno ai cinquantamila euro al chilogrammo, ciò non deve stupire se si pensa che per ottenere 0,3-0,4 grammi di assoluta è necessario un chilogrammo di rizoma ben stagionato. In Toscana il giaggiolo viene coltivato in zone tipiche, quali i monti del Chianti e le pendici del Pratomagno nell’aretino. I rizomi provenienti da queste zone sono estremamente apprezzati e richiesti dalle industrie profumiere, che li preferiscono a quelli provenienti da Marocco, India e Cina. Le elevate richieste di rizomi rendono indispensabile un aumento delle produzioni, limitate da metodi di propagazione, di tipo vegetativo, che prevedono l’utilizzo dei rizomi per la produzione delle barbatelle. Per ottenere colture di giaggiolo di elevato pregio, assicurare elevati standard qualitativi e quantitativi, è necessaria un’attività di selezione varietale, accompagnata da metodi di propagazione veloci, ripetibili e affidabili. Tra le tecniche di propagazione offerte dal panorama tecnologico contemporaneo, le tecniche di micropropagazione in vitro risultano essere le più adatte. In particolare la tecnica utilizzata è comunemente indicata con il termine di embriogenesi somatica, un particolare tipo di coltura in vitro, che permette di ottenere embrioni non-zigotici, da un tessuto indifferenziato chiamato callo.
Per realizzare un protocollo per la micropropagazione via embriogenesi somatica dell’I. pallida è stato condotto uno studio svolto dal team guidato dal Prof. Malorgio e dalla Dott.ssa Lucchesini dell’Università di Pisa e dalla Prof.ssa Mensuali della Scuola Superiore Sant’Anna. Lo sviluppo della micropropagazione dell’Iris pallida si pone come obiettivi quelli di fornire uno strumento efficace ed economicamente vantaggioso per le aziende leader in questo settore. Questo studio è stato basato sull'induzione dell’embriogenesi somatica su tessuti provenienti dai boccioli delle piante madri e da frammenti di foglie di plantule sviluppate in vitro. I primi dati ottenuti, relativi all’inquinamento degli espianti, hanno evidenziato che il bocciolo (fiore immaturo) è il miglior candidato per i test iniziali di induzione. Oltre ad aver testato differenti tipi di espianti (parti del bocciolo), sono stati condotti esperimenti su mezzi d’induzione che differiscono tra loro per la tipologia e la concentrazione dei regolatori di crescita, nonché dei componenti organici. Il mezzo di MS modificato contenente 0,1 mg L-1 di chinetina (Kin) e 1 mg L-1 acido 2,4-diclorofenossiacetico (2,4D) come mezzo di induzione per gli espianti dei fiori immaturi è risultato essere il più idoneo. Un altro mezzo MS modificato contenente 1 mg L-1 di Kin e 1 mg L-1 di 2,4D è risultato essere il più adatto per le colture successive di callo embriogenico. Per far sviluppare gli embrioni e mantenerne la formazione è stato utilizzatocome mezzo d’espressione,un mezzo Knudson C modificato, addizionato con 1 mg L-1 Kin e 0,1 mg L-1 acido indol-3-butirrico (IBA). Trasferendo gli embrioni ottenuti su un mezzo MS modificato contenete 0,1 mg L-1 di 6-benziladenina (BA) e acido α-naftalenacetico (NAA), è stato possibile ottenere plantule complete in vitro, da destinare all'acclimatazione ex vitro. La possibilità di indurre la formazione di callo embriogenico su espianti di foglie da plantule micropropagate (sterili e disponibili tutto l’anno) ha permesso di ottimizzare il processo di produzione. Il ciclo di propagazione via embriogenesi somatica è stato analizzato in dettaglio a partire da colture di callo ottenuto attraverso l’induzione di tessuti provenienti da plantule allevate in vitro di Giaggiolo toscano per sei subcolture successive al termine delle quali non era più possibile indurre la formazione di embrioni sul callo. Sulle piante ottenute sono stati effettuate analisi chimiche attraverso metodologia HPLC che hanno consentito di verificare che tale metodo di propagazione non ha effetti sulle presenza degli iridali. E’ stata svolta una caratterizzazione istologica degli embrioni somatici. Sono stati valutati, attraverso metodo fluorocitometrico, i contenuti di DNA al fine di comparare le piante madri e le piante rigenerate dal vitro. Tale analisi ha provato l’assenza di variazioni nella ploidia delle piante di I.pallida che vengono propagate con questo sistema. È stata realizzata l’estrazione di RNA dalle foglie per il sequenziamento con metodo ILLUMINA al fine di valutare i profili di espressione di alcuni geni implicati nella via di biosintesi dei triterpeni.
Infine sono stati prodotti dei semi artificiali, ottenuti inserendo gli embrioni somatici in capsule di alginato. Questi sono stati in grado di mantenere vitali gli embrioni e di permettere lo loro conservazione per lunghi periodi.
In definitiva considerando che un bocciolo potrebbe fornire una media di dodici espianti, i nostri risultati hanno dimostrato che in un ciclo della durata di sei mesi possono essere prodotte circa 150 piantine, con la possibilità di attuare altri cicli partendo dalle foglie delle plantule ottenute. Il callo ottenuto da queste foglie ha una capacità embriogenica di circa 30 embrioni/g di callo ed una germinazione degli embrioni del 50%. Da 1 grammo di espianti fogliari prelevati dalle piante in vitro, è possibile ottenere in circa 60 giorni 8 g di callo embriogenico, in grado di fornire in altri 20 giorni oltre 200 embrioni e quindi circa 100 piantine da acclimatare ex vitro. Le piante ottenute non presentano variazioni rilevanti dal punto di vista agronomico e produttivo. La possibilità di produrre semi artificiali potrà essere utilizzata per trasporto e/o scambio di materiale, in condizioni di asepsi e con una buona vitalità, nonché per la conservazione del germoplasma.
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