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Tesi etd-10082008-105614


Tipo di tesi
Tesi di laurea specialistica
Autore
ARENELLA, MARIARITA
URN
etd-10082008-105614
Titolo
estrazione e purificazione di proteine enzimatiche dal terreno: studi preliminari e approccio metodologico
Struttura
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE E TECNOLOGIE BIOMOLECOLARI
Commissione
Relatore Dott.ssa Masciandaro, Grazia
Parole chiave
  • beta glucosidasi
  • complessi umo-enzimaici
  • terreno
  • enzimi
Data inizio appello
27/10/2008;
Disponibilità
completa
Riassunto analitico
L'ecosistema suolo è ricco di proteine enzimatiche che possono essere raggruppate in due classi: intracellulari ed extracellulari.
L'attività degli enzimi intracellulari dipende dalla proliferazione microbica a
di erenza dell'attività di quelli extracellulari che vengono secreti nella fase
acquosa del terreno da cellule microbiche e vegetali metabolicamente attive
o in fase di lisi. Tali enzimi possono trovarsi liberi o stabilizzati dalla formazione di complessi con le sostanze umiche e le argille del terreno, sono
considerati una riserva di materia ed energia biochimica del suolo in quanto
la loro attività si svolge anche in condizioni proibitive per i microrganismi
e, per questo, sono stati proposti come le ultime difese biologiche del suolo
esposto a processi di degradazione irreversibili come la deserti cazione.
Il loro isolamento richiede studi laboriosi a causa della complessa matrice
rappresentata dal terreno; e a causa dell'eventuale formazione dei suddetti
complessi.
In questo lavoro di tesi si mira alla messa a punto di tecniche atte ad estrarre e puri care tali proteine dal terreno, con lo scopo ultimo di saggiare
la presenza e l'attività dell'enzima idrolitico beta-glucosidasi. Questo enzima
catalizza l'idrolisi del cellobiosio in glucosio (ultimo step della via catabolica della cellulosa) ed è quindi importante per il ciclo del carbonio e per la
"qualità" del suolo in generale.
La metodologia utilizzata ha previsto l'estrazione delle proteine extracellulari libere e di quelle legate alla componente umica attraverso l'impiego di
due estraenti. La componente microbica è stata allontanata dall'estratto attraverso ltrazione su membrana batteriologica 0,22 um. Per favorire la rottura
dei complessi formati tra proteine e sostanze umiche, l'estratto è stato sottoposto a trattamenti sici (shock termico). In seguito è stato desali cato
attraverso membrane da dialisi, e concentrato tramite ultra ltrazione.
A questo punto per allontanare le sostanze umiche in eccesso dall'estratto è stato e ettuato un passaggio di puri cazione utilizzando il polimero
polivinilpirrolidone. Il successivo step ha previsto la precipitazione delle proteine con il metodo che utilizza deossicolato e acido tricloroacetico (DOC-
TCA).
In ne sono state applicate elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni
denaturanti e non denaturanti (SDS-PAGE e NATIVE-PAGE) per visualizzare le proteine estratte nella forma denaturata e nativa con lo scopo ultimo
di ricercare la presenza dell'attività beta-glucosidasica.
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