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Tesi etd-10082008-105614


Thesis type
Tesi di laurea specialistica
Author
ARENELLA, MARIARITA
URN
etd-10082008-105614
Title
estrazione e purificazione di proteine enzimatiche dal terreno: studi preliminari e approccio metodologico
Struttura
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE E TECNOLOGIE BIOMOLECOLARI
Commissione
Relatore Dott.ssa Masciandaro, Grazia
Parole chiave
  • beta glucosidasi
  • complessi umo-enzimaici
  • terreno
  • enzimi
Data inizio appello
27/10/2008;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
L&#39;ecosistema suolo è ricco di proteine enzimatiche che possono essere raggruppate in due classi: intracellulari ed extracellulari.<br>L&#39;attività degli enzimi intracellulari dipende dalla proliferazione microbica a<br>di erenza dell&#39;attività di quelli extracellulari che vengono secreti nella fase<br>acquosa del terreno da cellule microbiche e vegetali metabolicamente attive<br>o in fase di lisi. Tali enzimi possono trovarsi liberi o stabilizzati dalla formazione di complessi con le sostanze umiche e le argille del terreno, sono<br>considerati una riserva di materia ed energia biochimica del suolo in quanto<br>la loro attività si svolge anche in condizioni proibitive per i microrganismi<br>e, per questo, sono stati proposti come le ultime difese biologiche del suolo<br>esposto a processi di degradazione irreversibili come la deserti cazione.<br>Il loro isolamento richiede studi laboriosi a causa della complessa matrice<br>rappresentata dal terreno; e a causa dell&#39;eventuale formazione dei suddetti<br>complessi.<br>In questo lavoro di tesi si mira alla messa a punto di tecniche atte ad estrarre e puri care tali proteine dal terreno, con lo scopo ultimo di saggiare<br>la presenza e l&#39;attività dell&#39;enzima idrolitico beta-glucosidasi. Questo enzima<br>catalizza l&#39;idrolisi del cellobiosio in glucosio (ultimo step della via catabolica della cellulosa) ed è quindi importante per il ciclo del carbonio e per la<br>&#34;qualità&#34; del suolo in generale.<br>La metodologia utilizzata ha previsto l&#39;estrazione delle proteine extracellulari libere e di quelle legate alla componente umica attraverso l&#39;impiego di<br>due estraenti. La componente microbica è stata allontanata dall&#39;estratto attraverso ltrazione su membrana batteriologica 0,22 um. Per favorire la rottura<br>dei complessi formati tra proteine e sostanze umiche, l&#39;estratto è stato sottoposto a trattamenti sici (shock termico). In seguito è stato desali cato<br>attraverso membrane da dialisi, e concentrato tramite ultra ltrazione.<br>A questo punto per allontanare le sostanze umiche in eccesso dall&#39;estratto è stato e ettuato un passaggio di puri cazione utilizzando il polimero<br>polivinilpirrolidone. Il successivo step ha previsto la precipitazione delle proteine con il metodo che utilizza deossicolato e acido tricloroacetico (DOC-<br>TCA).<br>In ne sono state applicate elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni<br>denaturanti e non denaturanti (SDS-PAGE e NATIVE-PAGE) per visualizzare le proteine estratte nella forma denaturata e nativa con lo scopo ultimo<br>di ricercare la presenza dell&#39;attività beta-glucosidasica.
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