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Archivio digitale delle tesi discusse presso l'Università di Pisa

 

Tesi etd-10012014-162859


Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale
Autore
AZZARA', ALESSIA
URN
etd-10012014-162859
Titolo
Studio di danno al DNA in soggetti obesi e nel ratto Zucker (modello animale di obesita)
Struttura
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOLOGIA MOLECOLARE E CELLULARE
Commissione
relatore Prof. Scarpato, Roberto
Parole chiave
  • obesità
  • h2ax
  • linfociti
  • dna damage
  • obesity
  • danno al dna
  • Zucker rats
Data inizio appello
20/10/2014;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
L’obesità è una condizione caratterizzata da un eccessivo accumulo di tessuto adiposo sottocutaneo (grasso corporeo) che determina gravi danni alla salute. La patologia è in costante aumento non solo nei paesi occidentali ma anche in quelli di basso reddito, rappresentando uno dei problemi di salute a livello mondiale. Obesità e sovrappeso sono considerati un fattore di rischio per diverse malattie: diabete mellito di tipo 2, malattie cardiovascolari, ipertensione, sindrome metabolica. Recenti studi ipotizzano una stretta relazione tra l’obesità e il rischio d’insorgenza di cancro, in particolare tumore renale, del colon retto, della mammella e dell’endometrio. La principale causa dell’obesità è uno squilibrio energetico tra calorie consumate e calorie spese, infatti, nell’ultimo ventennio vi è stato un aumento dell’assunzione dei cibi ricchi di grassi e una riduzione dell’attività fisica, il tutto dovuto a cambiamenti ambientali e sociali associati allo sviluppo. Una percentuale di individui obesi è dettata anche da cause di tipo genetico, come le mutazioni di specifici geni che determinano insulino-resistenza. Uno dei geni che è stato trovato mutato in condizioni di obesità è quello che codifica per il recettore della leptina, localizzato a livello dell’ipotalamo. La leptina è un ormone proteico che è prodotto da diversi tessuti (placenta, mucosa del fondo gastrico, il tessuto muscolare scheletrico) ma la maggiore produzione si localizza a livello del tessuto adiposo. L’aumento della secrezione della leptina è associato a un aumento della massa grassa, quindi con funzione anoressizzante, ma anche in presenza di citochine infiammatorie (TNFα e IL-1). “L’ormone della sazietà” si lega al suo recettore a livello del nucleo ipotalamico determinando l’inibizione di neuroni che producono sostanze che stimolano l’appetito, il quale viene ridotto. Con il presente lavoro è stata valutata la relazione tra la condizione di obesità e l’induzione di danno al DNA a livello:
1)di linfociti T circolanti di soggetti obesi in età pediatrica valutando sia la presenza di danno spontaneo sia la capacità di riparazione del danno indotto;
2)di linfociti T circolanti di soggetti obesi in età adulta;
3)di tessuti bersaglio potenzialmente interessati nella cancerogenesi nel ratto Zucker.
Il danno al DNA è stato caratterizzato utilizzando un noto marcatore nucleare, la fosforilazione dell’istone H2AX nella serina 139 (gamma-H2AX). La presenza di H2AX fosforilati nel nucleo ha un ruolo importante nella segnalazione delle rotture a doppia elica del DNA (Double Strand Breaks, DSBs) rappresentando uno degli eventi più importanti e immediati della risposta al danno al DNA (DDR). Per quanto riguarda il primo punto, è stato valutato il livello spontaneo di DSB e la capacità ripartiva delle lesioni (cinetica) da parte dei soggetti obesi e normopeso. Il danno spontaneo è stato valutato in colture di linfociti periferici non stimolati. La cinetica di riparazione è stata studiata in colture cellulari stimolate per 20 ore e trattate con mitomicina C (farmaco antitumorale ad azione mutagena) per 2 e 4 ore. La presenza dei foci gamma-H2AX (presenza e comparsa, riduzione e/o scomparsa) è stata valutata mediante immunofluorescenza. Nella seconda parte dello studio è stato monitorato lo stato di fosforilazione di H2AX (foci gamma-H2AX) ma anche l’eventuale presenza di stress ossidativo, dei linfociti periferici di individui adulti obesi che devono essere sottoposti a intervento chirurgico di bypass gastrico. Lo stress ossidativo è stato studiato andando a guardare lo stato di ossidazione dei lipidi di membrana tramite la sonda lipidica fluorescente C11-BODIPY, un analogo degli acidi grassi, permettendo di discriminare se è avvenuta o no ossidazione da parte di queste specifiche molecole. Il follow-up in soggetti tra i 25-45 anni d’età parte da un primo prelievo di sangue prima dell’intervento chirurgico, un secondo prelievo dopo un mese per la visita di routine post-operatoria e, un ultimo prelievo tre mesi dopo. Le diverse tempistiche di prelievo hanno permesso di valutare l’andamento nel tempo del danno genomico e dello stress ossidativo in relazione alla grave condizione di obesità a cui sono soggetti gli individui campionati, che dovrebbe ridursi a seguito dell’intervento chirurgico. Nell’ultima analisi della ricerca, la fosforilazione dell’istone H2AX è stata evidenziata attraverso esperimenti d’immunoistochimica su sezioni di diversi organi (cuore, tiroide, fegato, pancreas, polmone, rene, intestino). Il modello animale di obesità preso in esame è il ratto Zucker, di cui, i portatori di una mutazione in omozigosi nel gene che codifica per il recettore della leptina (fa/fa) sono gli obesi, mentre gli individui eterozigoti per la mutazione (fa/+) sono considerati controllo normopeso. La ricerca è stata condotta in parallelo su due gruppi di ratti con età compresa tra 2-5 settimane (baby rats, corrispondenti approssimativamente ai pazienti obesi di età pediatrica) e tra 9-13 settimane (young adult rats, corrispondenti approssimativamente ai pazienti obesi di età tra 25-45 anni). Ciascun gruppo (obesi e controlli) è stato a sua volta suddiviso in due sottogruppi sulla base dei livelli di glicemia: glicemia nel range di normalità per il sottogruppo dei cosiddetti “digiuni”, e condizione di iperglicemia acuta indotta nel sottogruppo dei ratti cosiddetti “iperglicemici”. Questo ha permesso di effettuare valutazioni sui livelli di fosforilazione dell’istone come indicatore di danno al DNA nell’organo in relazione sia alla condizione di obesità sia alla condizione glicemica e alla loro possibile interazione.
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