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Tesi etd-09042018-220824


Thesis type
Tesi di laurea magistrale
Author
ACETO, ROMINA
URN
etd-09042018-220824
Title
"Valutazione delle migliori strategie basate sulla tecnologia CRISPR/Cas9 per effettuare knock-in genico dello SNP rs4644 del gene LGALS3"
Struttura
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOLOGIA MOLECOLARE E CELLULARE
Commissione
relatore Prof. Landi, Stefano
Parole chiave
  • Genome editing
  • galectina-3
  • CRISPR/Cas9
  • knock-in
Data inizio appello
24/09/2018;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
24/09/2021
Riassunto analitico
Il sistema Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein (Cas) è un meccanismo di difesa immuno-adattativo utilizzato da Archea e Bacteria per la degradazione di materiale genetico estraneo. <br>Sono stati individuati tre diversi sottotipi di sistemi (Tipo I, II e III) che differiscono per il numero e per la tipologia di endonucleasi coinvolte. L’interesse della comunità scientifica si è rivolto in particolar modo verso il sistema CRISPR/Cas9 di tipo II, individuato per la prima volta in Streptococcus pyogenes, che risulta essere il migliore e il più utilizzato metodo per effettuare manipolazioni geniche, come ad esempio knock-in, knock-out e knock-down. Infatti, negli ultimi anni, grazie alla sua semplicità e versatilità, rispetto ad altre tecnologie in grado di indurre modificazioni genetiche (TALEN, ZFN), questa metodica è stata impiegata in diversi ambiti, quali terapia genica, ricerca di nuovi farmaci e biologia sintetica. <br>Il CRISPR/Cas9 di tipo II è costituito da una ribonucleoproteina, data dall’endonucleasi Cas9 a cui fa seguito un RNA guida di circa 20-nt (sgRNA), che dirige l’endonucleasi stessa. La ribonucleoproteina è in grado di identificare la sequenza trinucleotidica (NGG) PAM (Protospacer Adjacent Motifs), presente in più copie a livello del genoma, preceduta da una sequenza complementare al sgRNA, inducendo la formazione di un taglio al doppio filamento di DNA (DSB). La cellula risponde a quest’ultimo con due diversi meccanismi di riparazione: la ricombinazione non omologa (NHEJ), meccanismo error prone che induce mutazioni di tipo inserzione/delezione (indel), e la ricombinazione omologa (HDR), che ripara il danno DSB utilizzando un filamento di DNA stampo, senza inserire mutazioni. <br>Il presente elaborato si inserisce in un ampio progetto di ricerca, il cui scopo è quello di delineare il ruolo funzionale del polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) rs4644 nel gene LGALS3, per il quale è stata dimostrata un’associazione con il rischio di sviluppare diversi tipi di cancro. <br>A tal proposito, linee cellulari umane isogeniche che differiscono dalla linea parentale per il solo SNP di interesse saranno create mediante il sistema CRISPR/Cas9. Nello specifico sono stati utilizzati tre approcci differenti. Nel primo caso abbiamo impiegati due vettori, PX458 e PX459, dissimili esclusivamente per il marker di selezione, contenenti il gene codificante per la Cas9, la quale va ad indurre un taglio a livello del genoma inducendo un DSB nel DNA. Nel secondo caso è stata utilizzata una strategia diversa, nota come CRISPR double nickase, che va ad aumentare la specificità, diminuendo il numero di off-target e mantenendo un alto livello di efficienza. In quest’ultimo caso due plasmidi, ciascuno codificante per una Cas9 mutante, sono diretti verso una specifica regione del DNA genomico, dall&#39;RNA guida target specifico. Ciascun complesso Cas9/sgRNA crea un taglio al singolo filamento (SSB) e il doppio nick, creato dai due complessi, mima un DSB. La terza tecnica prevede l’impego di vettori lentivirali come mezzo di trasfezione di un plasmide contenente la Cas9 inducibile da doxyciclina e resistente alla puromicina e di un vettore con sgRNA target e resistenza alla blasticidina. La riparazione del DSB viene mediata da due elementi: un single-stranded donor oligonucleotides (ssODN), avente regioni fiancheggianti omologhe alla regione target e l’allele di interesse posto al centro della sequenza, o un donor vector avente braccia di omologia fiancheggianti il sito interessato dal danno. <br>Lo scopo della presente tesi è quello di individuare non solo il miglior sistema per effettuare il knock-in genico, inteso come l’impiego del CRISPR-cas9 in associazione con il ssODN o in associazione con il donor vector, ma anche la migliore sgRNA. Per quest’ultimo aspetto, ci si è avvalsi dell’utilizzo di un tool bioinormatico, quale CHOPCHOP. Nello specifico, sulla base degli off-target e della qualità sgRNA, sono state selezionate due guide, che riconoscono lo SNP di nostro interesse. <br>I dati preliminari mostrano, complessivamente, una buona specificità ed efficienza da parte delle sgRNAs utilizzate e dei tre approcci adoperati. Ulteriori saggi dovranno essere condotti allo scopo di determinare il miglior metodo e la miglior guida che ci permettano di ottenere le linee cellulari modificate. Analisi in silico come TIDER assay, ma anche genotipizzazione delle linee modificate dovranno essere effettuate per verificare l’effettivo gene-editing.<br>
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