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Tesi etd-09042009-173433


Tipo di tesi
Tesi di laurea specialistica
Autore
AULICINO, ANNA
URN
etd-09042009-173433
Titolo
Ligandi batterici e recettori cellulari coinvolti nell'interazione diretta tra Mycobacterium bovis, bacillo di Calmette e Guerin, e cellule natural killer umane
Struttura
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE E TECNOLOGIE BIOMOLECOLARI
Commissione
relatore Prof.ssa Batoni, Giovanna
Parole chiave
  • BCG
  • cellule natural killer
  • immunità innata
Data inizio appello
28/09/2009;
Disponibilità
parziale
Data di rilascio
2049-09-28
Riassunto analitico
Nel corso degli ultimi anni è diventato progressivamente evidente che lo sviluppo di una efficace risposta immunitaria specifica contro una varietà di agenti infettivi si determina in larga misura nelle prime fasi dell’interazione tra tali agenti ed i componenti cellulari dell’immunità innata (ad esempio macrofagi, cellule dendritiche, cellule natural killer-NK). Oltre che per la loro capacità di interferire direttamente con la moltiplicazione dei microrganismi, mediante la messa in atto di potenti funzioni effettrici, le cellule dell’immunità innata risultano, infatti, essenziali anche nel determinare il tipo e l’entità della susseguente risposta immunitaria specifica ed, in definitiva l’evoluzione più o meno favorevole di un’infezione.
La prima fase della risposta immune innata prevede l’interazione di recettori espressi dagli elementi cellulari che l’agente patogeno incontra alla porta di entrata, con componenti batterici superficiali. Lo studio di tali recettori e dei corrispondenti ligandi microbici ha suscitato grande interesse negli ultimi anni, in quanto è emerso che la loro interazione rappresenta un meccanismo evolutivamente conservato in grado di allertare il sistema immunitario dell’ospite contro la presenza di un microrganismo e di indirizzare la successiva risposta specifica verso il fenotipo più adatto all’eradicazione dell’infezione.
Le cellule dell’immunità innata riconoscono gli agenti infettivi tramite recettori definiti pathogen recognition receptors (PRRs) che sono codificati da geni fissi nel genoma e sono espressi, in maniera non clonale, anche su cellule appartenenti a linee differenziative diverse. Tali recettori riconoscono molecole presenti sulla superficie degli agenti infettivi, altamente conservate nell’ambito di grandi classi di microrganismi e denominate pathogen associated molecular patterns (PAMPs).
Il lavoro svolto nella presente tesi rappresenta la continuazione di studi da tempo intrapresi nel laboratorio ospitante riguardanti l’interazione diretta tra cellule NK dell’uomo e Mycobacterium bovis, bacillo di Calmette e Guérin (BCG), un ceppo attenuato utilizzato in molti studi come modello per la specie virulenta M. tuberculosis, l’agente eziologico della tubercolosi nell’uomo. Tali studi hanno dimostrato che BCG è in grado di interagire direttamente con cellule NK umane e di stimolare, in assenza di cellule presentanti l’antigene, molte delle loro funzioni effettrici quali la produzione di IFN-gamma, la proliferazione e l’attività citotossica nei confronti di target cellulari sensibili. Tali funzioni effettrici vengono completamente abrogate quando i batteri e le cellule sono separati da una membrana porosa che ne impedisce il contatto e sono indotte non solo da batteri vivi, ma anche da batteri uccisi e da preparazioni antigeniche arricchite in antigeni di parete di BCG. Ciò ha suggerito che l’interazione BCG-cellule NK possa coinvolgere il riconoscimento di componenti batterici superficiali da parte di specifici recettori cellulari. E’ noto che le funzioni effettrici delle cellule NK sono il risultato di un equilibrio tra stimoli attivatori e stimoli inibitori mediati da altrettanti recettori cellulari. I recettori attivatori includono quelli appartenenti alla famiglia dei Natural Cytotoxicity Receptors (NCRs), tre proteine indicate con la sigla NKp30, NKp44 e NKp46, od alcuni membri dei Toll-Like-Receptors (TLRs), una famiglia di PRRs ampiamente caratterizzata e coinvolta nel riconoscimento di una varietà di PAMPs. Utilizzando forme solubili commerciali dei vari recettori NCRs, il laboratorio in cui è stata svolta la tesi ha dimostrato recentemente che almeno uno di essi, NKp44, è capace di legarsi alla superficie di varie specie del genere Mycobacterium, incluso BCG e la specie virulenta M. tuberculosis. Altri Autori hanno dimostrato che almeno uno dei membri della famiglia dei TLRs, il TLR2, è coinvolto nell’interazione diretta BCG-cellule NK.

Scopo della presente tesi è stato quello di identificare i putativi ligandi batterici dei recettori cellulari coinvolti nell’interazione diretta tra BCG e cellule NK umane e di stabilire il ruolo di tale interazione sull’attivazione delle funzioni cellulari. Il lavoro sperimentale è stato svolto in tre fasi principali:

Nella prima fase si è proceduto ad allestire un saggio immunoenzimatico con componenti micobatterici purificati. Essi includevano componenti abbondanti nella parete dei micobatteri quali il lipoarabinomannano (LAM), gli acidi micolici (AM), il peptidoglicano (PG) e l’arabinogalattano (AG) usati singolarmente ed in associazione nel micolil-arabino-galattano-peptidoglicano (mAGP) che è considerato lo scheletro fondamentale della parete di tali batteri. Nel saggio sono stati anche inclusi, come controllo, componenti parietali di batteri Gram-positivi o negativi quali, ad esempio, gli acidi teicoici od il lipopolisaccaride. I vari componenti sono stati fatti aderire a piastre da 96 pozzetti e, dopo opportuni lavaggi, sono stati incubati con forme solubili commerciali dei recettori NCR, chimera per il frammento Fc delle IgG umane. Il legame recettore/ligando(i) è stato rivelato con un anticorpo secondario marcato con perossidasi specifico per l’Fc delle IgG umane. Tali esperimenti hanno dimostrato che il recettore NKp44 in forma solubile è in grado di legare in maniera stabile e dose dipendente componenti parietali micobatterici quali AG, AM, mAGP, ma non PG o LAM.

Nella seconda fase del lavoro si è proceduto ad allestire dei saggi funzionali allo scopo di valutare se i componenti parietali identificati fossero in grado di promuovere l’attivazione di cellule NK e la produzione, da parte di queste, di IFN-gamma, una citochina chiave capace di modulare l’attività di numerosi altri tipi cellulari dell’immunità innata e specifica. A tale scopo si è proceduto ad ottenere, per selezione negativa, una popolazione di cellule NK umane altamente purificate da sangue periferico di donatori sani. Tali cellule sono state stimolate in vitro con biglie di polistirene (pb) precedentemente ricoperte con lo scheletro fondamentale della parete dei micobatteri, il complesso mAGP, allo scopo di mimare la superficie batterica. I risultati ottenuti hanno dimostrato che al contrario delle biglie di controllo, quelle ricoperte con mAGP (pb-mAGP) stimolavano l’espressione su cellule NK di marker di attivazione quali il CD25 il CD69 ed anche del recettore attivatore NKp44. L’attivazione cellulare si accompagnava alla produzione di ingenti quantità di IFN-gamma, valutato nei sopranatanti di coltura dopo 3 giorni di stimolazione.

Allo scopo di valutare se l’attivazione delle funzioni cellulari osservata stimolando con pb-mAGP fosse dovuta all’interazione dei componenti parietali presenti sulla superficie delle biglie con i recettori NKp44 e/o TLR2, nella terza fase del lavoro si è proceduto a ripetere gli esperimenti di stimolazione in presenza di anticorpi bloccanti anti-NKp44 ed anti-TLR2. Tali esperimenti hanno dimostrato che mentre la presenza di anti-NKp44 nella coltura non influenzava il grado di attivazione cellulare e la produzione di IFN-gamma, la presenza di anti-TLR2 riduceva tali parametri funzionali a valori paragonabili a quelli delle colture prive di stimoli.

I dati ottenuti hanno dimostrato che: i) forme solubili del recettore attivatore NKp44 si legano a componenti della parete dei micobatteri quali l’arabinogalattano, gli acidi micolici ed il loro complesso che include il peptidoglicano (mAGP), ma non al peptidoglicano usato singolarmente; ii) il complesso mAGP stimola l’attivazione cellulare, induce l’espressione di NKp44 e la produzione di IFN-gamma da parte di cellule NK altamente purificate; iii) anticorpi bloccanti il TLR2, ma non NKp44 annullano l’attivazione cellulare e la produzione di IFN-gamma da parte di tali cellule NK.
Nel loro insieme tali dati suggeriscono che, almeno in una prima fase, l’attivazione delle cellule NK in seguito a stimolazione diretta con mAGP non sia dovuta all’interazione di MA e AG con NKp44; tale recettore è, infatti, espresso a livelli basali molto bassi su cellule “resting” mentre viene marcatamente indotto sulle cellule attivate. Dall’altro lato, il blocco dell’attivazione cellulare osservato utilizzando anticorpi anti-TLR2 suggerisce che il TLR2 possa rappresentare il recettore primario che, interagendo con il peptidoglicano (un componente micobatterico considerato un ligando di TLR2) presente in mAGP, determini l’attivazione delle funzioni effettrici. Secondo tale ipotesi, quindi, l’interazione di TLR2 con il peptidoglicano parietale potrebbe portare ad una attivazione delle funzioni cellulari e all’induzione del recettore NKp44. Quest’ultimo recettore potrebbe, quindi, interagire con altri componenti parietali, quali l’arabinogalattano e gli acidi micolici, perpetuando e mantenendo lo stimolo attivatorio.

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