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Tesi etd-09042009-115021


Thesis type
Tesi di laurea specialistica
Author
FAGGIONI, MICHELA
URN
etd-09042009-115021
Title
La catena pesante della ferritina come reporter gene per la localizzazione delle cellule staminali cardiache
Struttura
MEDICINA E CHIRURGIA
Corso di studi
MEDICINA E CHIRURGIA
Commissione
relatore Prof. Recchia, Fabio
relatore Prof. Pistello, Mauro
Parole chiave
  • cellule staminali
  • reporter gene
  • ferritina
Data inizio appello
22/09/2009;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
22/09/2049
Riassunto analitico
Premessa: la comprensione del comportamento delle cellule staminali dopo trapianto richiede lo sviluppo di nuove tecniche di marcatura e di rilevazione del segnale per il monitoraggio longitudinale della localizzazione e proliferazione cellulare. Scopo: il presente studio si propone di mettere a punto un metodo per il monitoraggio, in vivo, di cellule staminali cardiache residenti impiantate nel muscolo cardiaco e valutare gli effetti di queste cellule nel miocardio infartuato. Metodi: le cellule staminali cardiache residenti sono state ottenute attraverso digestione enzimatica di frammenti tissutali prelevati con biopsie dal miocardio sano di maiale. Una volta isolate le cellule desiderate, le cosiddette cellule formanti cardiosfere (CFCs), esse sono state trasdotte con il gene della catena pesante della ferritina (FTH), veicolato da un vettore virale derivato dal virus dell’immunodeficienza felina (FIV). Le cellule trasdotte così ottenute sono state messe in coltura per permettere la formazione di cardiosfere (Csp) e poi adoperate per gli esperimenti in vivo. Gli animali sono stati suddivisi in quattro gruppi. Gruppo I: animali infartuati che hanno ricevuto una iniezione intramiocardica di soluzione contenente Csp trasdotte (n=7); gruppo II: animali infartuati trattati con Csp non trasdotte (n=4); gruppo III: ratti infartuati trattati con iniezione intramiocardica di PBS (n=7); gruppo IV: ratti sani sottoposti ad iniezione di Csp trasdotte (n=5). L’infarto è stato provocato attraverso legatura della discendente anteriore. L’iniezione di 0,2 ml di campione è avvenuta a 45 minuti dalla chiusura del vaso nella zona adiacente all’infarto. Gli animali sono stati sottoposti a due esami di risonanza magnetica rispettivamente a 1 e 4 settimane dell’iniezione con un apparecchio 1,5 Tesla. La valutazione dell’accumulo di ferro intramiocardico è stata effettuata con sequenze gradient-echo T2* utilizzando multipli tempi di echo (2, 4.4, 6.4, 8.6, 10.8, 13, 15.2, 17.4 msec). Sono state acquisite anche immagini morfologiche e funzionali ed è stata misurata la dimensione dell’infarto grazie al delayed enhancement con mezzo di contrasto. Risultati: la trasduzione della catena pesante della ferritina ha permesso l’accumulo del ferro circolante all’interno delle cellule trapiantate e, quindi, la formazione di un segnale visibile alla RM senza la necessità di somministrare un mezzo di contrasto. Il segnale prodotto dall’accumulo di ferro è ben visibile anche con un apparecchio 1,5 T, ad una settimana dall’iniezione delle cellule ed è quantificabile misurando il valore T2*. Comparato a quello delle altre zone del miocardio, il valore T2* della zona dell’iniezione dei casi trattati con cellule trasdotte risulta nettamente inferiore. Dal punto di vista funzionale, paragonando i dati ottenuti dai ratti infartuati trattati con Csp con quelli degli animali infartuati trattati con solo fisiologica è possibile osservare un miglioramento della frazione di eiezione (FE), e dell’ ispessimento telesistolico nella zona peri-infartuale, sede dell’iniezione; è riscontrabile, inoltre, una riduzione dell’area infartuata negli animali trattati con Csp. L’analisi istologica con la colorazione di Perls ha confermato la presenza di un accumulo di ferro intracellulare. Grazie all’immunoistochimica è stato possibile riscontrare che le cellule iniettate si sono differenziate prevalentemente in fibroblasti e, in misura minore, in cellule endoteliali e cardiomiociti. Conclusioni: l’utilizzo del gene dalla FTH come reporter gene in cellule staminali cardiache residenti si è rivelato essere un metodo di marcatura efficace e sicuro, in grado di produrre un segnale tale da poter essere facilmente visualizzato con un apparecchio a 1,5 T. La RM permette un monitoraggio in vivo accurato delle cellule iniettate, nonché una valutazione della funzione cardiaca globale e regionale. L’accumulo di ferro non è risultato essere tossico per le cellule né, tanto meno, per l’organismo. Le Csp si sono dimostrate efficaci nel migliorare la funzione cardiaca globale e regionale, e nel ridurre l’area infartuata. La FE e la contrattilità parietale nei casi trattati con cardiosfere trasdotte risultano migliori rispetto ai controlli trattati con PBS in maniera statisticamente significativa. La differenziazione delle Csp ha però condotto alla formazione di un numero relativamente modesto di cardiomiociti, il che lascia supporre, in presenza di un miglioramento della funzione, che le Csp abbiano agito, anche e soprattutto, attraverso la secrezione di fattori paracrini in accordo con altri studi, su diversi tipi di cellule staminali, presenti in letteratura.
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