• bead milling
• DNA extraction
• frodi
• identificazione di specie

RIASSUNTO

Nel settore ittico, dove le frodi per sostituzione, sia involontarie che intenzionali, hanno raggiunto livelli allarmanti, le analisi molecolari sono sempre più utilizzate, sia da parte delle Agenzie Ufficiali che da parte dell’industria, al fine di verificare la tracciabilità e la qualità dei prodotti. L’estrazione del DNA rappresenta una fase necessaria e cruciale nella processazione del campione destinato alle analisi molecolari. Tra gli inconvenienti associate a questa procedura ricordiamo ad esmpio: l'uso di materiali tossici, la bassa resa e la scarsa produttività, dovuta alle procedure manuali molto laboriose. In questo lavoro, al fine di superare i problemi sopraelencati, abbiamo sviluppato un metodo alternativo basato su una procedura di frantumazione del tessuto con l’utilizzo di sfere metalliche (bead-milling) omettendo la fase di digestione mediante proteinasi K. Il nuovo metodo è stato confrontato sia con un protocollo salting out sviluppato in un lavoro precedente, sia con un kit commerciale. Sono stati valutati la resa, la purità spettrofotometrica, il livello di degradazione con utilizzo dell'elettroforesi e l'amplificabilità del DNA estratto. In particolare, l'amplificabilità del DNA è stata stimata mediante la comparazione dell'intensità delle bande, visualizzate in elettroforesi su gel, dopo l'amplificazione dei geni 16s rRNA e COI con la PCR convenzionale e i valori di take-off dopo l'amplificazione del gene 16s rRNA con la real-time PCR. I risultati hanno dimostrato che il metodo basato sul bead-milling permette di ottenere quantità accettabili di DNA con buona purità e buone caratteristiche di amplificabilità. Sebbene il metodo salting out rimanga un protocollo più efficiente in termini di purità, la procedura basata sul bead-milling può essere considerata una valida alternativa anche in relazione alla ridotte esigenze in termini di costi e manodopera.

Keywords: estrazione del DNA, bead milling, muscolo del pesce

ABSTRACT
In the fish food sector, where frauds have reached alarming levels, the molecular analysis is increasingly applied to to verify the quality of goods. DNA extraction represents a necessary and critical step for all types of DNA analysis. Among the drawbacks associated with this procedure, there are handling of toxic materials, low DNA yield and low throughput due to time-consuming manual procedures. In this work, to overcome some of these problems, we developed an alternative method based on a bead milling procedure without proteinase K digestion. The new method was then compared with both a salting out protocol developed in a previous work and a commercial kit. Yield, spectrophotometric purity, electrophoretic degradation pattern, and amplificability of the extracted DNA were assessed, In particular, DNA amplificability was evaluated by comparing the band intensity on the gel after amplification of the 16S rRNA and COI genes with a conventional PCR and the take-off cycles after amplification of the 16S rRNA gene with a real-time PCR. The results showed that the bead-based method allowed to obtain acceptable amounts of DNA, with good purity and good characteristics of amplificability. Although the salting out method remains the most effective protocol in terms of pure performances, the bead-milling procedure can be considered a valid alternative, in the light of its lower demand in terms of labor and costs.
Keywords: DNA extraction, bead milling, fish muscle.