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Archivio digitale delle tesi discusse presso l'Università di Pisa

 

Tesi etd-05092018-162642


Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale
Autore
AGOSTINI, SILVIA
URN
etd-05092018-162642
Titolo
Valutazione degli effetti del silenziamento di geni candidati in linee cellulari di mesotelioma pleurico maligno
Struttura
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOLOGIA MOLECOLARE E CELLULARE
Commissione
relatore Landi, Stefano
Parole chiave
  • mesotelioma pleurico maligno
  • amianto
  • silenziamento genico
  • IMP3
  • ASS1
  • MCT4
  • RAN
Data inizio appello
28/05/2018;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
28/05/2021
Riassunto analitico
Il mesotelioma pleurico maligno (MPM) è un tumore raro ed estremamente aggressivo che interessa la pleura. L’esposizione alle fibre di amianto è il fattore eziologico principale, ma esistono dei co-fattori come il Simian Virus 40 (SV40) e la suscettibilità genetica individuale che contribuiscono alla patogenesi della neoplasia. Ha un lungo periodo di latenza (40-50 anni) e un’aspettativa di vita media inferiore ad un anno al momento della diagnosi.
I meccanismi patologici e i geni coinvolti nello sviluppo della malattia sono ancora in parte sconosciuti, pertanto lo studio dell’espressione genica di linee cellulari di MPM può portare all’identificazione di nuovi target terapeutici.
Lo scopo di questa tesi è valutare il ruolo dei geni ASS1, IMP3, MCT4, RAN in linee cellulari immortalizzate di MPM e di mesotelio.
La scelta dei geni candidati si è basata in parte su un precedente lavoro di estesa revisione degli studi di trascrittomica presenti in letteratura arricchiti con ricerche di Data Mining che ha condotto all’identificazione di 119 geni deregolati, la cui espressione è stata validata in tessuti di MPM e di pleura non maligna tramite Real Time-PCR. I geni risultati sovraespressi sono poi stati valutati in due linee cellulari di MPM e comparati alla linea non maligna Met5A, individuando infine 28 geni upregolati in modo statisticamente significativo in almeno una linea cellulare. In questo modo si sono identificati i geni ASS1 e RAN.
Gli altri due geni oggetto di studio (IMP3 e MCT4) sono stati suggeriti dai risultati preliminari del lavoro dei ricercatori dell’Universitá di Salford (UK) con cui il Laboratorio di Genetica sta da anni collaborando.
Nel mio lavoro di tesi sono stati effettuati degli esperimenti in vitro di silenziamento genico, tramite l’utilizzo di RNA interference (siRNA), su 4 linee cellulari di MPM (Mero14, Mero25, Istmes2, NCI-H28) e una linea di mesotelio immortalizzata (Met5A). I siRNA, piccoli RNA con sequenza omologa al gene target da silenziare, degradano l’mRNA a livello post-trascrizionale, causando in questo modo un knock-down transiente dell’espressione genica.
L’avvenuto silenziamento è stato valutato tramite Real-Time PCR e Western blot. Invece le conseguenze del silenziamento sul fenotipo sono state determinate misurando i livelli di apoptosi (Caspase 3/7 assay), la capacità di formare colonie (Colony Formation Assay), il tasso di proliferazione (Sulphorhodamine (SRB) assay) e la capacità di migrare (Wound-Healing Assay).
Il silencing del gene IMP3 non ha indotto cambiamenti fenotipici degni di rilievo. I geni ASS1, RAN e MCT4, dopo silenziamento, inducono un decremento della proliferazione statisticamente significativo in tutte le linee di MPM. In particolare RAN e MCT4 determinano anche un aumento dell’attività caspasica in almeno una linea di MPM. Sulla base di questi risultati possiamo indicare questi geni come ottimi target nel mantenimento del fenotipo maligno del MPM.
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