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Tesi etd-03242015-185211


Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale
Autore
AULICINO, GIANUARIO
URN
etd-03242015-185211
Titolo
Analisi del profilo di espressione di una serie di noduli tiroidei mediante metodologia Nanostring
Struttura
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI E INDUSTRIALI
Commissione
relatore Prof. Basolo, Fulvio
relatore Dott. Giannini, Riccardo
Parole chiave
  • Diagnostica Tiroide
Data inizio appello
13/04/2015;
Disponibilità
completa
Riassunto analitico
I tumori della tiroide, che si manifestano clinicamente sotto forma di noduli, sono le più frequenti neoplasie che colpiscono il sistema endocrino. L'ultrasonografia, unita alla procedura dell’ago aspirato “FNAC” (Fine Needle Aspiration Citology, citologia aspirativa con ago sottile) vengono comunemente impiegati per la valutazione preoperatoria dei noduli tiroidei. Più del 30% dei campioni provenienti dagli agoaspirati che contengono un numero adeguato di cellule risultano indeterminati (categoria diagnostica TIR 3) all’esame citologico e non è possibile distinguere unicamente dalla citologia se la lesione tiroidea è di tipo benigno o maligno. Il problema fondamentale della diagnostica citologica riguarda la diagnosi differenziale tra adenoma follicolare (forma benigna) e variante follicolare del carcinoma papillare FVPTC, (Follicular Variant Papillar Thyroid Cancer): entrambi spesso frequenti (60% FA, 30% FVPTC) nei referti istologici finali successivi a tiroidectomie effettuate su pazienti TIR3. I due tipi di neoplasia presentano caratteristiche architetturali simili a tal punto da non poter riconoscere un tumore dall’altro In questi casi, la FNAC puo’ essere ripetuta oppure un successivo step chirugico puo’ risultare necessario (si parla di tiroidectomia totale o parziale) per ottenere una diagnosi istologica definitiva. I recenti progressi della genetica molecolare nel cancro alla tiroide hanno fornito dei marcatori molecolari diagnostici utili, specialmente per i casi di diagnosi indeterminata: Il carcinoma papillare (PTC, papillary thyroid carcinoma) , il più comune cancro maligno della tiroide, frequentemente presenta mutazioni nei geni BRAF, RET/PTC, o RAS. In letteratura inoltre sono citati vari casi di geni differenzialmente espressi nei tumori alla tiroide come nel caso di galectina-3, serpina1, fibronectina-1, cxcr4, geni la cui iperespressione risulta essere generata dall’insorgenza di neoplasie maligne, in particolare di carcinomi papillari. In questo studio è stato effettuata un’analisi di espressione genica (gene expression profiling) su una serie di campioni FNAC tramite la metodologia del Nanostring®. Questo dispositivo valuta l’espressione di geni di un pannello precostituito(nel nostro caso un pannello ad mRNA per 36 geni che risultano differenzialmente espressi tra noduli maligni e benigni) impiegando la tecnologia dell’ibridazione molecolare: ad ogni gene del pannello è stato associato un barcode molecolare fluorescente a sua volta associato ad una coppia di sonde (capture e reporter) che riconoscono e si legano alla sequenza nucleotidica dell’mRNA di interesse. L'obiettivo primario è stato quello di trovare una “signature molecolare”, ovvero un pattern di espressione genica che sia in grado di classificare i noduli come benigni o maligni. Sono stati valutati campioni FNAC ex-vivo prelevati da pazienti tiroidectomizzati (26 FNAC classificati TIR2, “ benigni”, e 27 casi di TIR 4-5, “sospetti maligni- maligni”) per i quali è stata effettuata anche una diagnosi istologica; le diagnosi istologiche sono servite come esami identificativi finali dei tumori per valutare i profili di espressione genica ottenuti dal Nanostring. Ai dati d’espressione genica ottenuti è stato applicato l’ algoritmo di Pearson per effettuare una prima clusterizzazione che ha distribuito i campioni in gruppi tramite valutazione delle distanze euclidee. Si è notata una certa differenza d’espressione tra i campioni maligni e benigni, i quali sono stati associati a 2 gruppi ben distinti. Successivamente tramite il test di Student sono stati selezionati quei geni che sono risultati più differenzialmente espressi tra i campioni clusterizzati. Riclusterizzando i dati tenendo conto questa volta solo dell’espressione di quei dei geni che sono risultati statisticamente significativi al t-test, le differenze nei profili di espressione tra i cluster benigni e maligni sono risultate molto più evidenti. Per poter confermare la suddivisione dei campioni tra benigni e maligni è stato impiegato un ulteriore algoritmo di calcolo, il K-nn (K-nearest neighbour). Il K-nn associa un punto agli n punti più vicini ad esso (n è un valore arbitrario, nel nostro caso abbiamo usato 3 per garantire che ci siano almeno due valori vicini su tre che possano permetterci di associare il punto ad un gruppo piuttosto che ad un altro) in termini di distanza euclidea. Il K-nn applicato per ogni singolo campione ha riconfermato la suddivisione iniziale data dall’istologia dei noduli. L’analisi d’espressione studiata per questi campioni costituisce parte di un training set da cui in futuro, con ulteriori dati e campioni disponibili, potrebbe scaturire la formulazione di un vero pattern genico d’espressione discrimitativo, una signature molecolare, per riconoscere la benignità o la malignità nello specifico per i casi di noduli indeterminati.
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