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Tesi etd-01142019-180323


Thesis type
Tesi di laurea magistrale
Author
AMATO, FRANCESCO
URN
etd-01142019-180323
Title
Sviluppo di metodi di funzionalizzazione superficiale per la rilevazione di GFAP in fluidi biologici
Struttura
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI
Commissione
relatore Prof. Cecchini, Marco
relatore Dott. Agostini, Matteo
Parole chiave
  • funzionalizzazione superficiale
  • fluidi biologici
  • rilevazione di GFAP
Data inizio appello
11/02/2019;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
11/02/2022
Riassunto analitico
La proteina fibrillare acida della glia (GFAP) è stata recentemente individuata come biomarcatore di gravi patologie cerebrali umane. Essa è presente nella circolazione periferica di pazienti affetti da patologie neurologiche, come il glioblastoma multiforme (GBM), uno dei tumori della glia più aggressivi, e in seguito a traumi cerebrali (traumatic brain injuries, TBI). Negli ultimi anni sono stati sviluppati alcuni biosensori in grado di rilevare l’adesione di GFAP su superfici sensibili, che hanno come obiettivo la diagnosi di GBM e TBI da campioni di pazienti. Di conseguenza c’è un grande interesse della comunità scientifica per lo sviluppo di metodi che conferiscano affinità e specificità alle superfici dei biosensori per la rilevazione di minime concentrazioni di GFAP in fluidi periferici.
Nel mio lavoro di tesi ho progettato e sperimentato quattro diversi metodi di funzionalizzazione (denominati F1A, F1B, F2, F3) per l’immobilizzazione di anticorpi anti-GFAP e successiva rilevazione di GFAP. Le misure sono state effettuate con una microbilancia a cristalli di quarzo con dissipazione (QCM-D), con sensori ricoperti di oro. Ciascuna funzionalizzazione è stata studiata per risolvere alcune delle principali problematiche nel processo di legame dell’analita (GFAP) tramite anticorpi: soppressione del legame aspecifico di molecole sulla superficie del sensore (F1A e F1B), orientamento degli anticorpi (F2), controllo della densità di ricoprimento superficiale con gli anticorpi (F3). Per F1A e F1B ho utilizzato streptavidina-PEG2k-SH (SV-PEG2k-SH) e due anticorpi biotinilati anti-GFAP (A e B). La presenza del glicole polietilenico (PEG) conferisce proprietà di resistenza a legami aspecifici (antifouling) alla superficie del sensore QCM. Per F2 ho ricoperto superficie del sensore QCM con la proteina-G tiolata (PrG-SH), la quale permette di legare il frammento costante dell’anticorpo anti-GFAP e orientarne la regione legante l’analita verso la soluzione. Per F3 ho invece applicato una tecnica di riduzione e successiva separazione dei ponti disolfuro che collegano le due metà degli anticorpi. Di conseguenza i gruppi -SH delle due metà dell’anticorpo vengono esposti alla superficie del sensore dorato. Gli anticorpi ridotti vengono così immobilizzati sul sensore con elevata densità superficiale. Ho condotto gli esperimenti usando phosphate buffered saline (PBS) contenente concentrazioni crescenti GFAP (da 2.2 pM a 2.2 uM). Confrontando i dati provenienti da tutte e quattro le funzionalizzazioni, F1A è risultata essere la migliore con un basso aspecifico e con un limite di rilevazione (LOD) di 34nM. Di conseguenza, questa tecnica è stata scelta per condurre esperimenti utilizzando del siero fetale bovino (FBS) come buffer, quindi contenente altre molecole ad alta concentrazione (come la bovine serum albumin, circa 40 mg/mL) che avrebbero potuto legarsi aspecificatamente alla superficie del sensore. I risultati ottenuti mostrano la capacità di F1A di rilevare la GFAP in maniera specifica in FBS, con un LOD di 86 nM, similmente a quanto ottenuto in PBS.
In conclusione, fra le tecniche di funzionalizzazione sperimentalmente verificate in questo lavoro di tesi, F1A è risultata essere quella maggiormente promettente per un’applicazione in ambito biosensoristico per la rilevazione di GFAP in siero umano. Il confronto diretto fra le varie tecniche di funzionalizzazione può inoltre essere prezioso per la progettazione di funzionalizzazioni rivolte alla rilevazione di altri tipi di analiti.
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