• Agonist
• antagonist
• CB2
• endocannabinoid receptor
• Invers agonist
• polifarmacologia
• Polypharmacology
• recettore degli endocannabinoidi
• Uptake

Polypharmacology features of 1,2-dihydro-6-methyl-2-oxopyridine-3-carboxamide derivatives as CB2 receptor modulators.


Sin dall’antichità la Cannabis Sativa è stata impiegata a scopo terapeutico, ricreativo o associata ai più svariati utilizzi in seguito ai suoi effetti psicoattivi. Solo nel 1964 è stato identificato il principio attivo responsabile degli effetti della cannabis, il Δ9THC (delta-9-tetraidrocannabinolo). Il sistema degli endocannabinoidi (ECS), il cui nome venne attribuito proprio all’attività del Δ9THC in tale sistema, rappresenta uno dei più importanti sistemi di neuro-modulazione del nostro organismo ed è implicato in una serie estremamente varia di condizioni fisiologiche e patologiche e nel mantenimento dell’omeostasi. Tale sistema è composto da due recettori accoppiati a proteine G, CB1 e CB2, (il primo presente prevalentemente a livello centrale e responsabile dell’effetto psicotropo tipico del Δ9THC mentre il secondo presente maggiormente a livello del sistema immunitario), da vari ligandi endogeni, tra cui i principali 2-AG (2-arachidonilglicerol) e Anandamide (N-arachidonil-etanolammina), dalle proteine adibite al trasporto intracellulare e attraverso la membrana (Endocannabinoid Membrane Transporter) e dagli enzimi preposti alla biosintesi e al metabolismo, tra cui troviamo il MAGL (Mono Acyl Glicerol Lipase) responsabile della degradazione del 2-AG ed il FAAH (Fatty Acid Amide Hydrolase) responsabile della degradazione dell’Anandamide. [1]
In letteratura sono stati riportati numerosi esempi di molecole che agiscono su uno dei componenti dell’ECS. In particolare, sono stati studiati diversi composti capaci di legarsi selettivamente al recettore CB2, in modo da ottenere la risposta desiderata ed evitare possibili effetti collaterali, quali gli effetti psicotropi legati all’attivazione del recettore CB1. Recentemente, comunque, è risultato di notevole interesse un approccio poli-farmacologico, ovvero lo studio di nuove molecole in grado di interagire su più target contemporaneamente.
Sulla base di questi presupposti, il mio lavoro di tesi svolto presso l’Istituto di Biochimica e Medicina Molecolare – Università di Berna è stato finalizzato alla determinazione dell’attività di potenziali modulatori selettivi del recettore cannabinoide CB2 sui principali target del sistema endocannabinoide, come gli enzimi adibiti alla degradazione degli endocannabinoidi endogeni quali MAGL, FAAH, ABHDs e hCOX-2 e il trasportatore di membrana specifico per gli endocannabinoidi. Le molecole testate sono state sintetizzate presso il Dipartimento di Farmacia dal gruppo di ricerca della Prof.ssa Clementina Manera nell’ambito di un progetto già in corso da diversi anni e che riguarda l’ottenimento di composti selettivi verso il recettore CB2. In particolare, i composti da me testati sono i derivati 2-oxo-1,2-diidropiridin-3-carbossiamidici di formula generale A e i derivati a struttura bifenilica di formula generale B. Sia i composti A che quelli B sono il risultato dello sviluppo di derivati precedentemente studiati di struttura generale C e D rispettivamente, che avevano mostrato una importante affinità verso il recettore CB2 accompagnata da un’interessante selettività. Era stato inoltre dimostrato che l’attività di questi derivati dipendeva, per i composti C dal tipo di sostituente presente in posizione 5 del nucleo piridinico[2], mentre per i derivati bifenilici D dal tipo di sostituente presente in posizione 1 del nucleo bifenilico[3].
La prima parte del mio lavoro di tesi ha riguardato, quindi, lo studio dei derivati 2-oxo-1,2-diidropiridin-3-carboxamide di struttura A che si differenziano dai derivati C precedentemente studiati per la presenza di un un gruppo metilico sul C6 del nucleo piridinico. Nei nuovi derivati bifenilici B, il metile e il n-butile presenti in posizione 1 nei derivati D, sono sostituiti da gruppi aril-alchilici.
L’affinità verso il recettore CB2 è stata valutata con la tecnica del binding competitivo contro il [3H]CP-55940 nei confronti dello stesso recettore espresso da cellule CHO (Chinese Hamster Ovary cells). Da questo saggio è risultato che i composti che hanno mostrato la maggior affinità sono i derivati di tipo A. Di questi composti, quelli che hanno evidenziato una IC50 < 1 µM, sono stati successivamente testati per valutare l'attività funzionale nei confronti del recettore CB2 con il saggio del [35S]GTPγS espresso da cellule CHO.
Da questo saggio è risultato che FM-6b che presenta il Bromo in C5 è risultato essere un agonista, mentre il composto AD-15b con il fenile nella stessa posizione ha mostrato un comportamento da agonista inverso, ed infine quello con il p-metossi-fenile (FM-5b) ha mostrato attività da antagonista neutro.
I risultati hanno confermato come il sostituente sul C5 del nucleo piridinico abbia mantenuto un ruolo determinante nell'attività funzionale della molecola, dimostrando di conseguenza che il metile in C6 non ha influenzato in alcun modo l’attività stessa. Inoltre è stato evidenziato che la presenza di un atomo di bromo in posizione C5 dei composti di tipo A e C porta all'ottenimento di molecole con attività agonista.
La presenza dell’ antagonista puro FM-5b ha permesso di ottenere informazioni più dettagliate a livello farmacologico nei confronti degli altri due composti (FM-6b e AD-15b). Curiosamente FM-5b ha mostrato un antagonismo competitivo nei confronti dell’agonista FM-6b ed un antagonismo non competitivo nei confronti dell’agonista inverso AD-15b.
Nella seconda parte del mio lavoro di tesi, i composti che avevano dimostrato profili migliori a livello di binding sono stati testati anche per determinarne l’attività nei confronti dei più importanti target del sistema endocannabinoide, tra cui gli enzimi MAGL, FAAH, ABHDs e hCOX-2. I risultati hanno, però, dimostrato che tali composti non presentano interazioni importanti alla concentrazione di 1 µM.
Il saggio che ha evidenziato i risultati più interessanti è stato quello relativo all’inibizione dell’uptake cellulare degli endocannabinoidi ad opera dell’ Endocannabinoid Membrane Transporter (EMT). L’EMT rappresenta un trasportatore di membrana non ancora clonato che controlla i movimenti bidirezionali del 2-AG e AEA attraverso la membrana[4]. È stato quindi effettuato uno screening dei composti più attivi secondo il saggio del binding competitivo. Dei composti con EC50 < 10 µM (FM-6b, AD-15b e FM-5b) è stata successivamente determinato il valore dell’EC50.
L’ultima parte del mio lavoro di tesi ha riguardato lo studio del processo di osteoclastogenesi in vitro, durante il quale si ha la formazione degli osteoclasti, ovvero delle cellule adibite alla degradazione e al rimodellamento osseo ed il cui aumento nella fase avanzata della vita rappresenta la principale causa di osteoporosi. Tale studio è stato intrapreso poiché, avendo a disposizione una serie di composti strutturalmente simili e con attività funzionale diversa (FM-6b, AD-15b e FM-5b) si è ritenuto di poter investigare in maniera completa il ruolo del recettore CB2 nel processo di osteoclastogenesi, che dai dati riportati in letteratura rimane tutt’ora piuttosto controverso. E' stato, infatti, riportato come inibitore dell’osteoclastogenesi sia un agonista del recettore CB2 [5],[6] che un agonista inverso [7],[8],[9],[10]
Durante il lavoro di tesi sono stati ottenuti osteoclasti dalle RAW cells (mouse leukaemic monocyte macrophage cell line), che verranno utilizzati successivamente per lo studio dell’attività delle nuove molecole.


Referenze

[1] Di Marzo et al., Nat. Rev. Drug Discov. 2004
[2] Lucchesi et al., Eur. J. Med. Chem. doi 2014
[3] Bertini et al., Eur J Med Chem. doi 2014
[4] Chicca et al., J. Bio. Chem. 2012
[5] Ofec et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006
[6] Rossi et al., Bone 2009
[7] Idris et al., Nat. Med. 2005
[8] Idris, Drug News Perspect 2008
[9] Whyte et al., Br. J. Pharmacol. 2012
[10] Schuehly et al., Chem. Biol. 2011