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• metiltransferasi
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• neurogenesis
• Xenopus laevis

Mettl9 è membro di un’ampia famiglia di geni denominati methyltransferase-like (METTL) genes, molti dei quali non sono ancora stati caratterizzati. La proteina omonima per cui codifica presenta un dominio di legame per l’S-adenosil metionina. METTL9 è infatti una metiltransferasi (MTases) S-adenosilmetionina dipendente, ed appartiene alla classe delle seven-β-strand (7BS) MTases.
Fino ad oggi pochi studi si sono concentrati su questo gene. Ricerche recenti su topo e cellule umane hanno mostrato che METTL9 è in grado di introdurre un gruppo metile sull’azoto in posizione 1 (N1) dell’anello imidazolico dell’istidina, in motivi His-x-His (dove x
è un qualsiasi aminoacido, preferibilmente di piccole dimensioni). Target di METTL9 sono proteine di vario genere; tra queste vi è la proteina NDUFB3 del Complesso I, la cui metilazione ad opera di METTL9 promuove la respirazione mitocondriale, come dimostrato
in esperimenti in vivo. Altri target di METTL9 sono coinvolti nel legame di vari metalli e in particolare dello zinco. Studi a riguardo lasciano ipotizzare che l’attività di METTL9 su tali proteine sia importante per la modulazione del legame di questi elementi.
Nel mio lavoro di tesi l’interesse è stato rivolto al contributo di Mettl9 nell’embriogenesi di Xenopus laevis, con l’intento di valutarne il profilo di espressione e un suo possibile coinvolgimento nella neurogenesi precoce. Per valutare l’espressione di Mettl9 è stata effettuata un’analisi qualitativa attraverso protocolli di ibridazione in situ, affiancata da un’indagine mediante PCR quantitativa. I risultati dell’analisi per ibridazione in situ mostrano
che Mettl9 è espresso in tutta la metà animale dagli stadi di blastula fino alle più precoci fasi
di gastrulazione; durante la neurulazione e agli stadi embrionali più tardivi l’espressione risulta maggiormente concentrata nei territori neurali. L’analisi per RT-qPCR mostra come i
livelli del trascritto di Mettl9 calino progressivamente a partire da stadi precoci di segmentazione (stadio 5), a eccezione di un modesto picco successivo a midblastula transition (stadio 10-), per poi stabilizzarsi durante la neurulazione. Per valutare il ruolo di Mettl9 sono stati svolti esperimenti di guadagno e perdita di funzione limitatamente alle fasi precoci di sviluppo embrionale, utilizzando il trascritto di Mettl9, nel primo caso, e oligonucleotidi morpholino antisenso diretti contro il trascritto di Mettl9, nel secondo caso. Gli embrioni così trattati sono stati analizzati mediante analisi dell’espressione di marcatori molecolari per valutare l’effetto dei trattamenti.

Mettl9 is a member of a large gene family called methyltransferase-like genes (METTL), many of which have not yet been characterized. Protein METTL9 has a binding domain for S-adenosyl methionine. METTL9 is indeed an S-adenosylmethionine dependent methyltransferase (MTases) and belongs to the seven-β-strand (7BS) MTases class.
To date, few studies have focused on this gene. Recent research on murine and human cells has shown that METTL9 is able to introduce a methyl group on the nitrogen at position 1 (N1) of the imidazole ring of histidine, in His-x-His motifs (where x is any amino acid, preferably a small one). Targets of METTL9 are proteins of various kinds; one among these is the Complex I protein NDUFB3, whose methylation by METTL9 promotes mitochondrial respiration, as demonstrated
in in vivo experiments. Other targets of METTL9 are involved in the binding of various metals, especially zinc. These studies suggest the activity of METTL9 is important for the modulation of the binding of these elements.
In my thesis work the interest was directed to the contribution of Mettl9 in the embryogenesis of Xenopus laevis, with the aim of evaluating its expression profile and its possible involvement in early neurogenesis. To evaluate the expression of Mettl9, a qualitative analysis was performed through in situ hybridization protocols, supported by quantitative PCR analysis. The results of the in-situ hybridization analysis show that Mettl9 is expressed in the animal pole from the blastula stages to the earliest stages of gastrulation; during neurulation and in the later embryonic stages the expression is more restricted in the neural territories. Analysis by RT-qPCR shows how Mettl9 transcript levels progressively decrease starting from early cleavage stages (stage 5), except for a modest peak following midblastula transition (stage 10-), and then stabilize during neurulation. To evaluate the role of Mettl9, gain and loss of function experiments were performed limited to the early stages of embryonic development, using synthetic Mettl9 transcript, in the first case, and antisense morpholino oligonucleotides directed against Mettl9 mRNA, in the second case. The treated embryos were analyzed through the expression of molecular markers to evaluate the effect of the treatments.