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Archivio digitale delle tesi discusse presso l'Università di Pisa

Tesi etd-12232020-161508


Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale
Autore
BOTRINI, CHIARA
URN
etd-12232020-161508
Titolo
Metabolismo del 4-idrossi-2-nonenale in una linea cellulare epiteliale umana di cristallino
Dipartimento
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOLOGIA MOLECOLARE E CELLULARE
Relatori
relatore Dott.ssa Moschini, Roberta
Parole chiave
  • hne
  • gs-dhn
  • cox-2
  • gsh
Data inizio appello
26/01/2021
Consultabilità
Non consultabile
Data di rilascio
26/01/2091
Riassunto
Il 4-idrossi-2-nonenale (HNE) è un’aldeide estremamente reattiva che viene prodotta in condizioni di stress ossidativo nel processo di perossidazione lipidica. L’HNE è bersaglio di una serie di attività enzimatiche che ne consentono un rapido metabolismo: può essere ossidato ad acido 4-idrossinonenoico (HNA) da attività aldeide deidrogenasiche (ALDHs), oppure può essere ridotto a 1,4-diidrossinonene (DHN) dall’alcool deidrogenasi (ADH) o da attività aldo-cheto reduttasiche (AKRs). L’HNE può inoltre andare incontro ad un processo di detossificazione andando a formare un addotto con il glutatione, il GS-HNE (3-Glutationil-4-idrossinonanale), in una reazione che può avvenire sia spontaneamente che per catalisi mediata dall’enzima glutatione S-transferasi (GST). Il GS-HNE può essere a sua volta ridotto da reduttasi NADPH-dipendenti quali l’aldoso reduttasi (AKR1B1) a GS-DHN (3-Glutationil-1,4-diidrossinonano) oppure ossidato da attività aldeide deidrogenasiche a formare GS-HNA (acido 3-glutationil-4-idrossinonanoico). Inoltre, il GS-HNE può essere sia ridotto che ossidato dalla carbonil reduttasi 1 (CBR1), enzima NADP-dipendente, andando a formare rispettivamente GS-DHN e GSHNA-γ-lattone. Lo studio del metabolismo dell’HNE è rilevante in quanto non solo rappresenta un sistema di difesa nei confronti dello stress ossidativo, ma anche perché alcuni prodotti della detossificazione di questa molecola potrebbero essere coinvolti in processi di segnalazione cellulari. Lo scopo di questa tesi è quello di approfondire il meccanismo di segnalazione che induce una risposta infiammatoria, evidenziata dall’espressione della ciclossigenasi 2 (COX-2), in una linea cellulare epiteliale umana del cristallino (HLEC B3) stimolata con HNE. Inizialmente è stata messa a punto una metodologia per la valutazione della concentrazione cellulare del GSH, del glutatione totale e dell’addotto GS-HNE, tramite la tecnica di elettroforesi capillare, utilizzando specifici standard a concentrazione nota. Tale tecnica è stata successivamente utilizzata per valutare la variazione dello stato redox di queste cellule, a diversi tempi di incubazione, in risposta alla stimolazione indotta dall’HNE. I risultati ottenuti hanno evidenziato la presenza, nelle HLEC, di un probabile derivato glutationilato dell’HNE dopo trattamenti per tempi brevi con l’aldeide, che va di pari passo con un calo significativo dei livelli di GSH e l’assenza, nelle condizioni sperimentali adottate, di un aumento di forme ossidate del glutatione. Parallelamente, nelle stesse condizioni sperimentali è stata osservata l’azione pro-infiammatoria dell’HNE, espressa dall’incremento dell’espressione di COX-2, tramite western blotting con l’utilizzo di anticorpi specifici. In questo contesto è stato approfondito un eventuale ruolo dell’aldoso reduttasi nella mediazione del processo infiammatorio tramite l’utilizzo del Sorbinil, noto inibitore dell’enzima. I risultati ottenuti mostrano l’incapacità della molecola di effettuare una significativa inibizione dell’espressione di COX-2. Questo risultato potrebbe essere correlato alla sua azione solo parziale nel ridurre l’attività GS-HNE reduttasica valutata su estratti grezzi. Nell’ipotesi quindi che il GS-DHN sia responsabile dell’innesco di una risposta infiammatoria mediata da NF-κB, sarà fondamentale procedere alla modulazione non solo dell’attività dell’aldoso reduttasi, ma anche di altri enzimi in grado di ridurre il GS-HNE come la CBR1.
Infine, è emerso un aspetto singolare nelle condizioni sperimentali adottate per la valutazione della risposta infiammatoria sulle HLEC stimolate con HNE. In particolare, la pre-incubazione delle cellule in un terreno senza FBS determina una forte inibizione dell’espressione di COX-2 mediata dall’HNE. Tale azione potrebbe essere correlata ad un fattore presente nel terreno che, tuttavia, non sembra influire sulla scomparsa dell’aldeide dal mezzo di incubazione.

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