• Chitosano
• ingegneria tissutale
• nanoparticelle magnetiche
• rigenerazione neurale
• Scaffold

La rigenerazione e il recupero dei tessuti nervosi costituiscono una grande sfida per la medicina odierna. I danni causati da traumi, lesioni o malattie neurodegenerative hanno un grande impatto sulla vita delle persone in quanto le strategie terapeutiche fino ad oggi utilizzate si sono rivelate poco soddisfacenti. I trapianti autologhi non sono sempre applicabili e possono essere causa di formazione di neuromi; quelli allogenici, d’altra parte, spesso causano il rigetto da parte dell’ospite.
Un approccio terapeutico del presente e del futuro per la medicina rigenerativa è costituito dall’ingegneria tissutale, una scienza interdisciplinare che ha l’obiettivo di sviluppare nuovi materiali di origine sintetica o naturale che possano andare a sostituire, riparare o rigenerare tessuti e organi malati o danneggiati. Le principali caratteristiche che devono possedere questi materiali sono: biocompatibilità con i tessuti, biodegradabilità con una velocità di degradazione ideale che dovrebbe corrispondere alla velocità di formazione del nuovo tessuto, assenza di tossicità e immunogenicità, ottime proprietà meccaniche.
In questo lavoro di tesi è stato utilizzato un polimero di origine naturale, il chitosano (Cs) per la creazione di supporti in bi- e tri-dimensione (film 2D e scaffold). È stato scelto il chitosano per la sua eccellente biocompatibilità e la caratteristica di rigonfiarsi trattenendo grandi quantità di acqua; tale materiale è inoltre biodegradabile e facilmente reperibile; viene infatti prodotto industrialmente per deacetilazione della chitina, estratta dall’esoscheletro dei crostacei.
Parallelamente, sulla base di pochi ma promettenti studi bibliografici è stato visto come lo stimolo di un campo magnetico esterno applicato ad una coltura cellulare neuronale possa indurre il cono di crescita assonale e promuovere l’elongazione del neurite, primo segnale di rigenerazione nervosa.
L’attività sperimentale ha previsto la sintesi di nanoparticelle magnetiche di magnetite (MNPs). La magnetite (Fe3O4) è un materiale inorganico biocompatibile, caratterizzato da bassa tossicità, facilità di funzionalizzazione e un comportamento super paramagnetico (i.e., quando il campo magnetico viene rimosso non esibisce nessuna magnetizzazione residua).
Le MNPs sono state funzionalizzate con gelatina di tipo B bovina per conferire una carica superficiale negativa e limitarne l’aggregazione in sospensione per repulsione di carica elettrostatica. Le MNPs sono state sospese in una soluzione acquosa di chitosano alle concentrazioni teoriche del 20% e 40% (w/w rispetto al Cs), per la creazione di supporti bi- e tri-dimensioniali.
I film 2D sono stati preparati tramite la tecnica solvent casting. La fabbricazione degli scaffold è avvenuta invece mediante manifattura additiva (MA), tecnologia che permette un controllo avanzato sulla loro micro e macrostruttura. In particolare, è stata impiegata la tecnica Computer-Aided Wet-Spinning (CAWS), basata sull’estrusione e deposizione controllata di una soluzione o sospensione polimerica direttamente all’interno di un bagno di coagulazione.
Sono stati ottimizzati i parametri di stampa per la fabbricazione di scaffold circolari (diametro di 15 mm) costituiti da 11 layer. È stata confermata la porosità degli scaffold ottenuti tramite microscopia ottica.
Dei film è stata effettuata una caratterizzazione chimico-fisica: valutazione della bagnabilità mediante misura dell’angolo di contatto; valutazione delle proprietà termiche con analisi termogravimetrica (TGA) e valutazione di proprietà meccaniche in trazione.
Per la caratterizzazione biologica è stata scelta una linea cellulare di schwannoma , le RT4D6P2T.
Le cellule di Schwann producono la guaina mielinica che avvolge gli assoni dei neuroni periferici e sono le prime che si attivano e guidano la ricrescita degli assoni in caso di lesione nervosa.
Sono stati effettuati test preliminari per valutare la citocompatibilità dei supporti di chitosano con e senza MNPs; i test sono stati effettuati in condizioni controllo e applicando un campo magnetico esterno di 15 mT alle colture cellulari sui supporti. Sono stati effettuati saggio colorimetrici di proliferazione a 24h e 48 h dalla semina delle cellule, e saggi di vitalità cellulare tramite marcatori e microscopia a fluorescenza.


The regeneration and recovery of nerve tissues is a major challenge for today's medicine. Damage caused by trauma, injury or neurodegenerative diseases has a great impact on people's lives as the therapeutic strategies used to date have proved to be unsatisfactory. Autologous transplants are not always applicable and can cause the formation of neuromas; Allogeneic ones, on the other hand, often cause rejection by the host.
A therapeutic approach of the present and the future for regenerative medicine is tissue engineering, an interdisciplinary science that aims to develop new materials of synthetic or natural origin that can replace, repair or regenerate diseased or damaged tissues and organs. The main characteristics that these materials must possess are: biocompatibility with tissues, biodegradability with an ideal degradation rate that should correspond to the speed of formation of the new tissue, absence of toxicity and immunogenicity, excellent mechanical properties.
In this thesis, a polymer of natural origin, chitosan (Cs), was used for the creation of bi- and three-dimensional supports (2D films and scaffolds). Chitosan was chosen for its excellent biocompatibility and the characteristic of swelling by retaining large amounts of water; This material is also biodegradable and easily available; In fact, it is industrially produced by deacetylation of chitin, extracted from the exoskeleton of crustaceans.
At the same time, on the basis of a few but promising bibliographic studies, it has been seen that the stimulation of an external magnetic field applied to a neuronal cell culture can induce the axonal growth cone and promote the elongation of neurite, the first signal of nerve regeneration.
The experimental activity involved the synthesis of magnetic magnetite nanoparticles (MNPs). Magnetite (Fe3O4) is a biocompatible inorganic material, characterized by low toxicity, ease of functionalization, and super paramagnetic behavior (i.e., when the magnetic field is removed it exhibits no residual magnetization).
MNPs were functionalized with bovine B-type gelatin to impart a negative surface charge and limit their aggregation in suspension by electrostatic charge repulsion. MNPs were suspended in an aqueous solution of chitosan at theoretical concentrations of 20% and 40% (w/w compared to Cs), for the creation of two- and three-dimensional supports.
The 2D films were prepared using the solvent casting technique. The scaffolds, on the other hand, were manufactured using additive manufacturing (MA), a technology that allows advanced control over their micro and macrostructure. In particular, the Computer-Aided Wet-Spinning (CAWS) technique was used, based on the extrusion and controlled deposition of a polymer solution or suspension directly inside a coagulation bath.
The printing parameters for the fabrication of circular scaffolds (15 mm diameter) consisting of 11 layers have been optimized. The porosity of the scaffolds obtained by light microscopy was confirmed.
A chemical-physical characterization of the films was carried out: evaluation of wettability by measuring the contact angle; evaluation of thermal properties with thermogravimetric analysis (TGA) and evaluation of mechanical properties in tension.
For the biological characterization, a schwannoma cell line, the RT4D6P2T, was chosen.
Schwann cells produce the myelin sheath that surrounds the axons of peripheral neurons and are the first to activate and guide the regrowth of axons in the event of nerve injury.
Preliminary tests were performed to evaluate the cytocompatibility of chitosan supports with and without MNPs; the tests were carried out under controlled conditions and by applying an external magnetic field of 15 mT to the cell cultures on the supports. Colorimetric proliferation assays were performed at 24h and 48h after cell seeding, and cell viability assays using markers and fluorescence microscopy.