ETD system

Electronic theses and dissertations repository

 

Tesi etd-12192018-152532


Thesis type
Tesi di laurea magistrale
Author
BROGI, LETIZIA
URN
etd-12192018-152532
Title
Effetto degli 1,3-1,6 β-glucani in zebrafish sapje, come modello di distrofia muscolare
Struttura
SCIENZE VETERINARIE
Corso di studi
SCIENZE E TECNOLOGIE DELLE PRODUZIONI ANIMALI
Commissione
relatore Dott. Fronte, Baldassare
correlatore Dott. Santorelli, Filippo Maria
Parole chiave
  • sapje
  • Duchenne Muscular Dystrophy
  • β-glucans
  • zebrafish
  • β-glucani
  • distrofia muscolare di Duchenne
Data inizio appello
25/01/2019;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
Riassunto
La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una malattia neuromuscolare che colpisce 1 bambino su 3500 ed è caratterizzata dalla mancanza di produzione di distrofina e dalla disregolazione autofagica (fagocitosi endocellulare). È anche noto come l’autofagia rivesta un ruolo fondamentale nella risposta immunitaria innata e adattativa. Inoltre, è stato osservato che molti nutrienti svolgono un ruolo importante nel recupero della funzione autofagica, con benefici a livello dei muscoli distrofici (rallentata degenerazione). Tra questi, i ß-glucani sono in grado di modulare la funzione immunitaria modificando l'attività fagocitaria di cellule immunocompetenti e in particolare dei macrofagi. Quindi, considerando la relazione tra l’evoluzione delle lesioni muscolari da DMD correlate alla disfunzione autofagica, il ruolo dell’autofagia nella risposta immunitaria e la funzione immunomodulante dei ß-glucani, il presente studio ha avuto come scopo quello di verificare se l’esposizione di embrioni di zebrafish sapje, modello di distrofia muscolare, a concentrazioni crescenti di 1,3-1,6 ß-glucani, avesse un effetto sulla evoluzione della DMD.
Il presente studio è stato condotto presso il laboratorio di acquacoltura e “zebrafish facility” del Dipartimento di Scienze Veterinarie dell’Università di Pisa, in collaborazione con IRCCS Fondazione Stella Maris (Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico), con sede in Calambrone (Pisa). A questo scopo, embrioni di zebrafish sapje sono stati incubati per 24 ore e successivamente esposti a concentrazioni crescenti di 1,3-1,6 β-glucani (estratti dalla parete cellulare di Saccharomyces cerevisiae). Allo scopo di verificare l’effetto dei trattamenti, a 96 hpf (hour post-fertilization), gli embrioni sono stati sottoposti al test della birifrangenza, per discriminare i soggetti distrofici da quelli non distrofici. Infine, a 120 hpf, gli stessi embrioni sono stati sottoposti a un test per la valutazione delle performance locomotorie mediante Daniovision®.
Molti dei test e dei trattamenti effettuati, sono stati condotti anche previa decorionazione degli embrioni e/o sonicazione dei ß-glucani.
Da quanto osservato, di per sé, la decorionazione preventiva degli embrioni ha significativamente “migliorato” le performance locomotorie degli embrioni, mentre, al contrario, l’uso di ß-glucani sonicati ha fatto osservare un peggioramento delle stesse. Nel complesso, le performance di locomozione degli embrioni sono state significativamente migliorate quando gli embrioni sono stati preventivamente sottoposti a decorionazione ed i ß-glucani non sonicati e, a seguire, quando embrioni non decorionati venivano esposti a ß-glucani sonicati (limitatamente al tempo cumulativo di movimento); negli altri casi, è cioè con embrioni decorionati e ß-glucani sonicati e embrioni non decorionati e ß-glucani non sonicati, le performance risultavano essere fortemente “limitate”.
Considerato quindi quanto detto, l’effetto dell’esposizione a concentrazioni crescenti di 1,3-1,6 ß-glucani è stato valutato esclusivamente tenendo in considerazioni quanto osservato su embrioni decorionati trattati con ß-glucani non sonicati e embrioni non decorionati trattati con ß-glucani sonicati. Un miglioramento delle performance locomotorie è stato così osservato in seguito all’esposizione degli embrioni a concentrazioni di 2 e 8 mg L-1. Questo risultato, osservato sia su embrioni distrofici che non distrofici, è stato confermato particolarmente dalle performance locomotorie di embrioni distrofici. Per di più è stato osservato come il trattamento con ß-glucani a concentrazione di 2 e 4 mg L-1 abbia determinato una significativa riduzione dell’incidenza dei fenotipi distrofici.
In conclusione, questi risultati sembrano suggerire che il mantenimento dell'integrità dei ß-glucani (non sonicati) meglio preservi l'attività biologica degli stessi ma che, allo stesso tempo, la sonicazione permetta il superamento della barriera corionica. In tal senso, comunque, sono necessari ulteriori studi. Per quanto riguarda invece il trattamento della DMD, gli 1,3-1,6 ß-glucani hanno fatto osservare un miglioramento delle performance locomotorie di tutti gli embrioni e, cosa più rilevante, di quelli distrofici. Questa evidenza, quindi, sembra aprire la possibilità di un loro impiego nella terapia della DMD.
Abstract
Duchenne muscular dystrophy (DMD), a neuromuscular disease that affects 1 out of 3500 children, is characterized by the lack of dystrophin production and autophagic dysregulation (endocellular phagocytosis). It is also known that autophagy plays a fundamental role in innate and adaptive immune responses. Furthermore, it has been observed that many nutrients play an important role in the recovery of autophagic function, with benefits in the dystrophic muscles (slower degeneration). Among these, ß-glucans are able to modulate immune function by modifying the phagocytic activity of immunocompetent cells and in particular of macrophages. Therefore, considering the relationship between the evolution of muscular lesions by DMD related to autophagic dysfunction, the role of autophagy in the immune response and the immunomodulatory function of ß-glucans, the present study aimed to verify whether the exposure of zebrafish sapje embryos, a model of muscular dystrophy, at different concentrations of 1,3-1,6 β-glucans, had an effect on the evolution of DMD.
The present study was carried out at the aquaculture laboratory and "zebrafish facility" of the Department of Veterinary Sciences of the University of Pisa, in collaboration with IRCCS Fondation Stella Maris (Institute of Hospitalization and Care with a Scientific Character), based in Calambrone (Pisa). For this purpose, zebrafish sapje embryos were incubated for 24 hours and subsequently exposed to different concentrations of 1,3-1,6 β-glucans (extracted from the cell wall of Saccharomyces cerevisiae). In order to verify the effect of the treatments, at 96 hpf (hour post-fertilization), the embryos were subjected to the birefringence test, in order to discriminate the dystrophic and non-dystrophic subjects. Finally, at 120 hpf, the same embryos were subjected to a test for the assessment of locomotor performance (Daniovision®).
Many of the tests and treatments carried out were also performed after embryo dechorionation and/or sonication of ß-glucans.
The preventive dechorionation of the embryos has significantly "improved" the locomotor performance of the embryos while, on the contrary, the use of sonicated ß-glucans showed opposite results. Overall, embryo locomotion performance was significantly improved when embryos were previously subjected to dechorionation and non-sonicated ß-glucans and, subsequently, when non-decorated embryos were exposed to sonicated ß-glucans (limited to cumulative time of movement); in the cases of dechorionated embryos and sonicated ß-glucans and non-dechorionated and non-sonicated ß-glucans, the performances were strongly "reduced".
The effect of exposure to rising concentrations of 1,3-1,6 ß-glucans was evaluated exclusively on dechorionated embryos treated with non-sonicated ß-glucans and non-dechorionated embryos treated with sonicated ß-glucans. An improvement in locomotor performance was thus observed following exposure of embryos to concentrations of 2 and 8 mg L-1. This result, observed both on dystrophic and non-dystrophic embryos, has been confirmed in particular by the locomotor performances of dystrophic embryos. Moreover, it was observed that treatment with ß-glucans at a concentration of 2 and 4 mg L-1 resulted in a significant reduction in the incidence of dystrophic phenotypes.
In conclusion, these results seem to suggest that the maintenance of the integrity of the ß-glucans (non-sonicates) better preserves their biological activity; at the same time, the sonication allows the overcoming of the chorionic barrier in chorionated embryos; nonetheless, to this regard, however, are necessary further studies. As for the treatment of DMD, 1,3-1,6 ß-glucans showed an improvement in the locomotor performance of all embryos and, more importantly, dystrophic ones. This evidence, therefore, seems to open the possibility of their use of 1,3-1,6 ß-glucan in the DMD therapy.

File