• Natural Killer
• glicodendroni
• PAMAM

UNIVERSITÀ DI PISA

Facoltà di Farmacia

Corso di Laurea Magistrale in
Chimica e Tecnologia Farmaceutiche


Tesi Sperimentale:

Sintesi di glicodendroni portanti epitopi glicidici attivi come agonisti recettoriali delle cellule Natural Killer (NK)


Relatore:
Dott.ssa Felicia D’ANDREA

Candidata:
Silvia PROFILI



Anno Accademico 2010-2011
La componente cellulare dell’immunità innata [fagociti, cellule natural killer (NK) e cellule dendritiche (CDs)], svolge un ruolo determinante nella risposta immunitaria contro agenti potenzialmente pericolosi (non-self) come virus, batteri, tessuti trapiantati, cellule neoplastiche ed altre sostanze e/o proteine estranee all’organismo. Essa svolge un ruolo determinante nella risposta immunitaria che si esplica sia in una diretta ed immediata attività citotossica rivolta all’eliminazione del patogeno, che nell’attivazione dell’intero sistema immunitario attraverso la produzione di una serie di segnali chimici come citochine, chemochine ed interferoni. Le cellule NK svolgono, grazie alla presenza di recettori superficiali di attivazione e di inibizione, un ruolo fondamentale nel determinare la risposta di attacco nei confronti di cellule riconosciute come infette o modificate (non-self) o di tolleranza per quelle riconosciute come proprie e, per questo motivo, sono oggetto di un crescente interesse nelle terapie antitumorali non farmacologiche. Studi effettuati dal Prof. Kren dell’Accademia Ceca delle Scienze (Praga), hanno evidenziato che tra i ligandi capaci di attivare le NK di ratto mediante un’interazione specifica con il recettore proteico NKR-P1, un ruolo importante è ricoperto da vari glicidi mono- e disaccaridici contenenti unità N-acetil-D-esosamminiche (GlcNAc, GalNAc, TalNAc, ManNAc).1a In particolare i disaccaridi, sintetizzati in precedenti ricerche nel Laboratorio dove è stata svolta questa Tesi, a struttura -TalNAc-(1→4)-Glc e -ManNAc-(1→4)-Glc mostrano un’attività agonista del recettore NKR-P1 più elevata di quella degli analoghi a struttura -GalNAc-(1→4)-GlcNAc e -GalNAc-(1→4)-ManNAc,1b vista la loro maggiore stabilità in vivo per l’assenza di enzimi idrolitici della porzione β-esosamminica.1a Inoltre studi recenti2 hanno mostrato che la 1-desossinojirimicina (1, DNJ) e gli azadisaccaridi (2-5) in cui le N-acetil-D-esosammine attive, sono legate attraverso un legame -glicosidico ad una unità DNJ, strutturalmente correlata al glucopiranosio (Glc), sono degli ottimi agonisti sia del rettore NKR-P1 di ratto che del recettore CD69 umano. In particolare i risultati biologici, oltre ad evidenziare un’attività agonista della DNJ, finora conosciuta come specifico inibitore di glicosidasi, hanno mostrato che gli azadisaccaridi risultano più attivi (1-2 ordini di grandezza) degli analoghi disaccaridici contenenti l’unità D-Glc al posto della DNJ.2


Partendo da questi risultati e considerando che l’attività biologica di strutture saccaridiche è spesso amplificata con la costruzione di strutture che espongono gli epitopi glucidici come copie multiple su uno scaffold di natura dendrimerica di tipo poliamminoammidico (PAMAM), scopo della tesi è stato la preparazione di glicodendroni di prima generazione (n=2) portanti le strutture β-D-ManNAc-(14)-Glc, β-D-ManNAc-(14)-DNJ e DNJ in grado di amplificare l’attività agonista attraverso una presentazione multivalente dei glicidi attivi. In particolare il lavoro di Tesi ha previsto due obiettivi distinti: a) la preparazione dei derivati saccaridici 6-8, portanti in posizione anomerica o sull’azoto anulare uno spaziatore funzionalizzato con un gruppo precursore di isotiocianati come un gruppo azidico o ammidico; b) la sintesi dei corrispondenti glicodendroni mediante caricamento di questi glicidi, attraverso un legame tioureidico, sulla matrice poliammidoamminica (PAMAM-NH2).



Intermedio chiave della sintesi dei disaccaridi 6 e 7 è il derivato -D-Mannopiranoside 11 (Schema 1), facilmente preparabile dal -D-talopiranoside 9 già presente in Laboratorio, per epimerizzazione al C-4 attraverso un’eliminazione regioselettiva di acetone, base catalizzata (t-BuOK, THF, riflusso) a dare il 4,5-esenopiranoside 10, benzilazione al C-3 (BnBr, KOH, THF, 18-crown-6), seguita da idroborazione-ossidazione regio- e stereoselettiva del doppio legame enoletereo (BH3∙MeS, THF e H2O2, NaOH). La sintesi dell’azide 6 ha previsto la preparazione del glicosil donatore triclorocetimmidato 12 mediante debenzilazione catalitica (MeOH, H2, Pd/C 10%,), ricostituzione dell’unità riducente glucosidica per idrolisi acida delle funzioni acetaliche (AcOH 80%, 80°C), peracetilazione con Ac2O-Py (1:2 v/v), desacetilazione anomerica regioselettiva (NH2NH2•AcOH, DMF) seguita da trattamento con CCl3CN in CH2Cl2 in presenza di DBU, una base che permette di ottenere il più stabile -12, quale prodotto termodinamico della reazione.

Schema 1



Il donatore 12, avente un gruppo partecipante in posizione 2 che garantisce la -stereoselettività della reazione di glicosidazione, è trasformato in 6 previa -glicosidazione con 3-O-tosil-propandiolo utilizzando il sistema attivante BF3.Et2O in CH2Cl2 anidro, seguita da sostituzione nucleofila del tosile con un gruppo azidico (NaN3, DMF).
La preparazione dell’azadisaccaride 7 (Schema 2) è realizzata a partire dall’intermedio 11 previa trasformazione nel corrispondente derivato D-xilo-aldoesos-5-ulosio (15) attraverso doppia amminazione riducente intramolecolare (amminociclizzazione). Il 5-cheto derivato 14 è preparato da 11 mediante 5,6-de-O-isopropilidenazione regioselettiva (AcOH 80%, 40°C) seguita da formazione selettiva di un 5,6-stannilidenacetale intermedio (Bu2SnO, PhMe) in condizioni di rimozione azeotropica dell’acqua, seguita da apertura ossidativa regioselettiva al C-5 con NBS.
Schema 2


Sottoponendo il chetone 14 a idrolisi acida blanda (TFA 90%) si realizza, oltre alla rimozione del gruppo 2,3-O-isopropilidenico residuo, anche esposizione della funzione aldeidica, ottenendo il dicarbonilico 15 la cui struttura, vista la complessità degli spettri NMR (1H e 13C) per la presenza di più forme tautomeriche, è stata indirettamente provata dalla successiva reazione di doppia amminazione riducente. La reazione condotta con N-Boc-etilediammina acetato e NaBH3CN in MeOH (60°C, 24 h) ha fornito, con completa stereoselettività, l’atteso azadisaccaride 16 (resa 51% calcolata da 14) a configurazione D-gluco. La successiva rimozione dei gruppi benzilici in posizione 3’ e 6’ mediante idrogenazione catalitica seguita da acetilazione convenzionale (Ac2O-Py) fornisce l’atteso peracetil derivato 7.
La sintesi della DNJ, funzionalizzata sull’azoto anulare, 8 è stata effettuata seguendo una metodica riportata in letteratura da Baxter e Reitz3 per la preparazione di analoghi imminozuccherini N-alchilati. La 5,6-O-de-isopropilidenazione selettiva (AcOH 60%) del commerciale diaceton-D-glucosio 18, seguita da ossidazione regioselettiva al C-5 con il sistema Bu2SnO-NBS in analogia a quanto descritto nella preparazione di 14, fornisce il 5-cheto derivato 19 in resa del 75%.
Schema 3



La completa rimozione acida delle funzioni acetaliche (TFA 90%) di 19, seguita da amminociclizzazione riduttiva, utilizzando N-Cbz-Etilendiammina cloridrato nelle stesse condizioni descritte nella preparazione di 16, fornisce un grezzo che, dopo acetilazione convenzionale e purificazione cromatografica, permette di ottenere 8 in resa (30%) paragonabile con quanto riportato in letteratura per composti analoghi.
La coniugazione con la matrice PAMAM-(NH2)2 (21), preparata nell’ambito di precedenti ricerche svolte in laboratorio, prevede la trasformazione dei saccaridi 6-8 nei corrispondenti 13, 17 e 20 (Schema 1, 2 e 3) aventi un gruppo funzionale isotiocianato in grado di reagire efficacemente con le funzioni amminiche della matrice poliammidoamminica (PAMAM). In particolare il disaccaride 6 è trasformato in 13 via riduzione selettiva dell’azide per idrogenazione catalitica (H2, EtOH, Pd/C 10%) condotta in presenza di HCl metanolico, seguita da trattamento con 2-piridil-tionocarbonato (DPT), un reagente alternativo al tiofosgene (CCl2S2), in grado di operare la trasformazione di un’ammina primaria in isotiocianato in condizione blande e meno nocive. La rimozione selettiva del gruppo terz-butossicarbonilico (CH2Cl2-TFA-H2O) o del gruppo benzilossicarbonilico (H2, EtOH, Pd/C 10%), presenti negli azazuccheri 7-8 seguita da trattamento con 2-piridil-tiocarbonato (CH2Cl2, Et3N, t.a.), in analogia a quanto visto nella preparazione di 13, permette la conversione dell’ammina nei corrispondenti isotiocianati 17 e 20. La reazione di coupling tra i glicidi 13, 17 e 20 e la diammina 21 (Schema 4) condotta in CH2Cl2-DMF a 40°C ha portato, dopo purificazione flash cromatografica dei residui, ai derivati tioureidici protetti 22, 23 e 24 (resa rispettivamente del 53, 54 e 56% calcolate da 21) che, dopo rimozione completa dei gruppi esterei (MeONa/MeOH, 0.33 M) forniscono i desiderati target 22a-24a.
Schema 4



Esperimenti NMR mono (1H, 13C) e bidimensionali (COSY, HETCOR, DEPT-135) hanno permesso di determinare la struttura e la stereochimica di tutti i prodotti ottenuti in questa Tesi ed i dati spettroscopici sono concordi con le strutture proposte. I glicodendrimeri 22a-24a saranno testati dal Prof. V. Křen di Praga con lo scopo di determinarne l’eventuale amplificazione dell’attività agonista nei confronti dei recettori NKR-P1 di ratto e CD69 umano.

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1. (a) Krist, P.; Herkommerova-Rajnokova,E.; Rauvolfova, J.; Semenuk, T.; Vavruskova, P.; Pavlicek, J.; Bezouska, K.; Petrus, L.; Kren, V. Biochem. Biophis.Res.Commun., 2001, 287, 11; (b) Attolino, E.; Bonaccorsi, F.; Catelani, G.; D’Andrea, F.; Krenek, K.; Bezouska, K.; Kren, V.; Bezouska, K. J. Carbohydr. Chem. 2008, 27, 1.
2. (a) Catelani, G.; D’Andrea, F.; Griselli, A.; Guazzelli, L.; Bezouška, K.; Křenek, K.; Křen, V.; Bioorg. Med. Chem. Lett., 2010, 10, 4645; (b) Catelani G.; D’Andrea F.; Gragnani T.; Griselli A.; Křenek K; Bezouška K; Křen V. Synthesis of new aminosugars as potential activators of natural killer cells, XVI EuroCarb, Sorrento, 2011; CP ???
3. Baxter, E. W.; Reitz, A., B. J. Org. Chem 1994, 59, 3175.