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Introduzione: Le colture d’organo rappresentano un metodo alternativo alla sperimentazione animale in vivo attraverso cui è possibile osservare il comportamento e le interazioni tra la maggior parte delle popolazioni cellulari presenti in condizioni fisiologiche e studiarne la risposta in seguito a modulazione. L’obiettivo della ricerca è stata la modulazione di un modello di coltura di cute (Skin Organ Culture, SOC) canino, precedentemente validato, per simulare fenomeni infiammatori di tipo allergico e settico ex vivo, e la messa a punto di un modello equino innovativo che permetta lo studio di aspetti legati alla cicatrizzazione nel cavallo. La rilevanza clinica è relativa alla dermatite atopica, la sepsi e la comprensione della fisiopatologia del tessuto di granulazione esuberante (EGT) del cavallo; quest’ultimo obiettivo è stato affrontato anche attraverso l’utilizzo di colture cellulari primarie di fibroblasti e cheratinociti equini in monostrato.
Dermatite atopica: è una patologia cutanea allergica cronica con elevata incidenza nell’uomo e nel cane, caratterizzata da eritema e prurito. Metodi: la cute prelevata da 3 cani è stata trattata con composto 48/80 (c48/80) a 10 e 100 µg/mL per indurre degranulazione dei mastociti e simulare una risposta allergica; sul modello sono stati valutati gli effetti della n-palmitoilglucosamina (PGA 30 µM), una glucosamina con effetto ALIA capace in vitro di down-modulare la degranulazione mastocitaria. I campioni e il terreno di coltura sono stati prelevati a due diversi time-point e sottoposti rispettivamente ad indagini istologiche e biochimiche. Sono stati analizzati: la degranulazione dei mastociti, la variazione del calibro dei capillari del plesso superficiale cutaneo e il rilascio di istamina nel mezzo di coltura. Risultati: aumento dose-dipendente della degranulazione dei mastociti, del rilascio di istamina nel mezzo e della vasodilatazione indotti dal c48/80, contrastata in modo significativo dal trattamento con PGA.
Sepsi: è una disfunzione multiorgano causata da una risposta anomala a un’infezione, una condizione clinica riscontrata nell’uomo e nel cane, in cui rappresenta una causa di eutanasia elettiva nelle unità di medicina d’urgenza. Metodi: la cute prelevata da 3 cani è stata trattata con LPS 10 µg/mL e le biopsie e il mezzo di coltura sono stati prelevati a 2, 24 e 48h dal trattamento. Sono stati analizzati la concentrazione di ossilipine nel mezzo di coltura e il calibro dei capillari del plesso superficiale nelle biopsie. Risultati: aumento della concentrazione di isoprostani 15-F2t-IsoP, 15-E2t-IsoP e 5-epi-5-F2t-IsoP, trombossano B2, prostaglandina E2, lipossina B4, e vasodilatazione superficiale nei campioni trattati con LPS rispetto al controllo.
EGT: rappresenta un disordine fibroproliferativo del cavallo caratterizzato da eccessiva formazione di tessuto di granulazione, che eccede i margini della ferita e si sviluppa preferenzialmente agli arti. i) SOC Metodi: la cute è stata prelevata dal tronco e dal metatarso di 2 cavalli in seguito ad eutanasia. Sono stati valutati gli effetti di EGF (10 e 20 µg/mL) e desametasone (10 μg/mL) sullo spessore epidermico e la lunghezza delle lingue epiteliali a 3-5-7 giorni. Risultati: aumento dello spessore epidermico e della lunghezza delle lingue epiteliali nel tronco e diminuzione di tali parametri nell’arto con il trattamento con EGF. ii) COLTURE CELLULARI Metodi: colture primarie di fibroblasti normali (DF) e prelevati da tesssuto di granulazione esuberante (EF), e cheratinociti equini sono state utilizzate per valutare caratteristiche morfologiche degli EF e l’effetto di molecole bioattive rilasciate nel mezzo di coltura (CM) sull’ espressione di proteine citoplasmatiche (tramite immunofluorescenza, IF), velocità di migrazione (tramite scratch test) e proliferazione cellulare (colorazione con trypan blue). Risultati: differenze morfologiche tra EF e DF; aumento dell’espressione di F-actina e α-SMA nei DF e un aumento della loro velocità di migrazione quando vengono trattati con il mezzo di coltura (CM) prelevato da EF; aumento della velocità di migrazione e della proliferazione dei cheratinociti quando vengono trattati con CM prelevato da DF e EF.
Conclusioni: 1) Modulazione di un modello canino ex-vivo per ricreare fenomeni fisiopatologici complessi per trovare nuovi target terapeutici (dermatite atopica) o nuovi marker biochimici (sepsi). 2) Set up di un modello ex vivo equino per lo studio della fisiopatologia dell’EGT. 3) Valutazione dell’influenza che i mediatori rilasciati da DF e EF esercitano su altri tipi cellulari.

Introduction: Organ cultures represent an alternative method to in vivo animal studies that allow us to study the behavior and interactions between different cell types, and observe their response after stimulation. The objective of the research is to modulate a model of an already established canine skin organ culture (SOC) to simulate an inflammatory process ex vivo, and to set up a novel equine model to studie wound healing process in horses. Clinical relevance is relative to atopic dermatitis and sepsis of dogs, and exuberant granulation tissue (EGT) of horses; this last objective was also carried out with primary cell culture of equine fibroblasts and keratinocytes.
Atopic dermatitis: is an allergic chronic cutaneous disease with high incidence in humans and dogs, characterized by itch and erythema. Methods: skin collected from 3 dogs was treated with compound 48/80 (c48/80) 10 e 100 µg/mL to induce mast cell degranulation and simulate an allergic response; the effects of palmitoylglucosamine (PGA 30 µM), a glucosamine with ALIA effect which is able to downmodulate mast cell degranulation in vitro, were evaluated. Skin biopsies and culture medium were sampled at two different time-point and submitted to histological and biochemical analysis, respectively. Mast cell degranulation, modification of capillary lumen, histamine content in culture medium were analyzed. Results: dose-dependent increase of mast cell degranulation, histamine release in culture medium and vasodilation induced by c48/80, reverted by PGA.
Sepsis: is an organ dysfunction caused by a dysregulated host response to infection that is found in humans and dogs, where it represent a major cause of elective euthanasia in critical care units. Methods: Skin collected from 3 dogs was treated with LPS 10 µg/mL, and biopsies and culture medium were sampled at 2, 24 and 48h after treatment. Oxylipins concentration in culture medium and vascular size were analized. Results: Increase of the concentration of isoprostanes 15-F2t-IsoP, 15-E2t-IsoP e 5-epi-5-F2t-IsoP, tromboxane B2, prostaglandin E2, lipoxin B4, and vasodilation of capillaries of superficial plexus in samples treated with LPS.
EGT: is a fibroproliferative disorder characterized by excessive granulation tissue formation, that develops on limb wounds. i) SOC Methods: Skin was harvested from body and limb of 2 euthanized horses. Effects of EGF (10 e 20 µg/mL) e dexamethasone (10 μg/mL) on epidermal thickness and length of epithelial tongue were analized at 3, 5 and 7 days. Results: increase of epidermal thickness and epithelial tongue lenght with EGF treatment in body, but not in limb. ii) CELL CULTURE Methods: primary cell culture of normal dermal fibroblasts (DF), EGT-derived fibroblasts (EF) and keratinocytes were used to evaluate the morphological aspects of EF and the effects of bioactive molecules released in culture medium (CM) on protein expression (immunofluorescence), migration rate (scratch test), and cell proliferation (trypan blue staining). Results: difference in EF and DF morphology; increase of F-actin e α-SMA expression and of migration rate of DF when treated with EF CM; increase of migration rate and proliferation of keratinocytes when treated with both EF and DF CM.
Conclusions: 1) Modulation of canine ex vivo model to recreate complex physiopathological processes to find new therapeutical target (for atopic dermatitis) or new biochemical markers (for sepsis) 2) Set up of a new ex vivo model in horses to study the physiopathology of EGT. 3) Evaluation of the effects of mediator released by DF and EF on other cell types.