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Tesi etd-12052009-161754


Thesis type
Tesi di dottorato di ricerca
Author
REMEDI, ALESSANDRO
URN
etd-12052009-161754
Title
Effetti della luce sulla respirazione cellulare: Ruolo della Citocromo c Ossidasi
Settore scientifico disciplinare
BIO/05
Corso di studi
BIOLOGIA EVOLUZIONISTICA (PROTISTI, ANIMALI, UOMO, ECOLOGIA MARINA, BIOTECNOLOGIE E BIOSICUREZZA DELL'AMBIENTE COSTIERO)
Supervisors
tutor Prof. Di Giuseppe, Graziano
tutor Prof. Cercignani, Giovanni
Parole chiave
  • saccharomyces cerevisiae
  • tetrahymena thermophila
  • irraggiamento luminoso
  • citocromo ossidasi
  • ATP
Data inizio appello
15/01/2010;
Consultabilità
Completa
Riassunto analitico
In letteratura sono descritti alcuni effetti sul metabolismo e sulla vitalità cellulare dovuti a irraggiamento con luce rossa o vicino-infrarosso (NIR) (Karu, 1999; Koutna et al., 2003; Vladimirov et al., 2004; Wan-Ping Hu et al., 2007, Eells et al. 2003; Whelan et al., 2003, Karu et al. 2005). La luce blu intorno a 420 nm e la luce rossa inducono inoltre, in mitocondri isolati, un incremento nella fosforilazione degli adenilati e nel consumo di O2 durante l’irraggiamento (Kato et al., 1981; Veshkin, 1991). Anche se non ci sono risultati inconfutabili, è stato suggerito che la citocromo c ossidasi (CcOX) sia il possibile fotoaccettore primario alla base di questi fenomeni.
Nella prima fase del mio progetto di dottorato ho sviluppato la mia ricerca con l’intento di chiarire il probabile ruolo di fotoaccettore in vivo della CcOX, ed eventualmente comprenderne il meccanismo. Successivamente ho cercato di chiarire il ruolo biologico di una modulazione della cinetica della respirazione da parte della luce. A tale scopo, ho scelto come modelli sperimentali il ciliato Tetrahymena thermophila che vive in ambienti esposti alla luce solare ed è dotato di un numero elevato di mitocondri. Il lievito Saccharomyces cerevisiae che è in grado a seconda dell’ambiente di utilizzare oppure no la via fosforilativa.
Come sistema di misura è stato utilizzato l’elettrodo ad ossigeno tipo Clark e come parametro per l'analisi della variazione dell'attività enzimatica il rapporto tra la velocità di consumo di O2 durante l'irraggiamento e la velocità iniziale misurata al buio.
In una prima fase ho effettuato misure in vivo su cellule di T. thermophila, e di S. cerevisiae cresciuto in condizioni aerobie. L'irraggiamento con luce visibile (390 <  < 700 nm), nelle nostre condizioni sperimentali, induceva un considerevole incremento nella velocità di consumo di O2 di queste cellule. Tale aumento di velocità di respirazione era funzione della lunghezza d’onda ed era massimo per la banda spettrale del blu.( 390 <  < 440 nm). Un effetto modesto ma stabile era stato misurato anche con la luce arancio-rossa (570 <  < 700 nm).
Le curve dose-effetto di T. thermophila ottenute utilizzando queste due bande spettrali, mostravano che la differenza fra le entità di attivazione con le due bande spettrali era comparabile con quella dei due picchi principali della CcOX a valenza mista.
Inoltre, il lievito S. cerevisiae coltivato in condizioni di semi-anaerobiosi, in cui è dimostrata una riduzione dell’espressione di alcune subunità della CcOX, mostrava un basso livello di respirazione cellulare basale e un trascurabile incremento del consumo di ossigeno indotto dalla luce.
Questo risultato era confermato dalle risposte ottenute con cellule di S. cerevisiae affette da una mutazione nell’espressione della subunità VIb della CcOX, in cui non c’era alcuna risposta alla luce, che si otteneva invece nella sua specie selvatica.
L’insieme dei risultati descritti suggeriva fortemente un coinvolgimento della CcOX nell’aumento di velocità misurato durante l’irraggiamento.
Per comprendere il meccanismo alla base del fenomeno osservato sono state condotte delle misure con l’inibitore della CcOX Sodio Azide (N3Na). L’inibitore, a parità di concentrazione, aveva meno effetto su cellule irraggiate rispetto a cellule non irraggiate. Questo è un risultato interessante anche se non permette di comprendere del tutto il meccanismo che sta alla base dell’effetto della luce.
Benché i meccanismi di base legati all’irraggiamento non siano troppo chiari, i risultati ottenuti effettuando misure a differenti fasi della crescita delle colture suggeriscono un ruolo rilevante della luce sulla fisiologia cellulare. Infatti, le curve dose-effetto misurate nelle diverse fasi di crescita delle colture di T. thermophila indicavano che sia la respirazione basale sia l’entità dell’aumento della respirazione in risposta all’irraggiamento luminoso erano dipendenti dalle differenti età della coltura.
L’insieme dei risultati ottenuti nel periodo di dottorato mostrano che la CcOX è coinvolta nell’aumento della respirazione cellulare e danno alcune indicazioni sul meccanismo d’azione della luce nei confronti dell’enzima, ma non consentono una spiegazione esaustiva.
Indicano un possibile ruolo della luce nella regolazione del metabolismo cellulare in natura. Poiché tutti i nostri esperimenti sono stati effettuati mantenendosi il più possibile vicini alle condizioni naturali, le indicazioni da noi ottenute suggerirebbero un coinvolgimento dello stesso ciclo solare nella regolazione della fisiologia cellulare dei microorganismi.
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