• network di regolazione genica
• alcol deidrogenasi
• lievito

Oggetto: Riassunto della tesi “Caratterizzazione genetica e molecolare di una mutazione nel gene ADH1 di Saccharomyces cerevisiae “.

Il presente lavoro ha l’obiettivo di caratterizzare ceppi di Saccharomyces cerevisiae resistenti all’alcol allilico (AA95, AA95petite, AA60, 1A e 1B) e sensibili (RV5-1, Hy e 1014). I cinque ceppi resistenti presentano una duplicazione di 69 bp nel gene ADH1. La mutazione in esame è affiancata da due o tre sequenze consensus di 8 bp che si ipotizzano essere siti di riconoscimento per un’endonucleasi coinvolta nei processi di ricombinazione.
L’attività sperimentale ha riguardato:
a) L’analisi dei trascritti dei geni Alcohol Dehyrogenase 1,2,3 (ADH1, ADH2, ADH3) , dei geni regolatori della trascrizione SWItching deficient 1 (SWI1) ed Sucrose Non Fermentable 2 (SNF2) e il gene Cruciform Cutting Endonuclease (CCE1). Questa fase si compone di: purificazione degli mRNA, RT-PCR e PCR per i geni di interesse.
b) L’analisi dei profili proteici dei ceppi, sia mutanti sia sensibili, mediante zimogramma. Le differenze riscontrate nei profili della sintesi proteica dei ceppi mutanti e sensibili sono state messe in evidenza attraverso la colorazione per l’attività degli enzimi Alcol deidrogenasi 1 e 2 (Adh1, Adh2) su gel di poliacrilammide a partire da estratto crudo di lievito.
I dati sull’espressione genica mostrano che gli otto ceppi analizzati trascrivono il gene ADH1 mentre il gene ADH2 viene trascritto nei tre ceppi sensibili ma non in quelli mutanti. Sono visibili amplificati per il gene ADH3 in tutti i ceppi in esame tranne che nel ceppo mutante mitocondriale petite (AA95petite). Nei ceppi resistenti (1A, 1B, AA95, AA60 e AA95petite) oltre alla mancata espressione del gene ADH2, non si ha espressione del gene SWI1; per quanto riguarda il gene SNF2 esso è sottoespresso a concentrazioni di glucosio comprese tra il 5% e il 2% mentre i trascritti di SNF2 risultano essere assenti a concentrazioni di glucosio più basse (0.5% - 0.1%). Nel ceppo wildtype 1014, nell’ibrido Hy e nel ceppo revertante RV 5-1 sono identificati i trascritti sia per SWI1 sia per SNF2. Questi risultati confermano la specificità di funzione del complesso SWI/SNF nel controllo di ADH2. Infine, l’analisi dei trascritti per il gene CCE1, endonucleasi codificata nel mitocondrio e coinvolta nel riconoscimento delle sequenze consensus presenti sul gene ADH1, evidenzia che questo gene è presente sia nei ceppi sensibili sia in ceppi mutanti ma i suoi livelli di trascritto sono più alti in presenza dei ceppi resistenti all’alcol allilico (1A, 1B, AA95, AA60, AA95 petite).
L’analisi dei profili proteici mostra che la duplicazione di 69bp presente nei ceppi mutanti non riduce l’attività catalitica dell’enzima Adh1. Come atteso l’enzima wild type e quello mutante mostrano profili di migrazione distinti e nei ceppi resistenti viene soppressa l’attività proteica di Adh2. Differentemente da quanto atteso il ceppo sensibile RV5-1, revertante per la mutazione in ADH1, ha un profilo di migrazione di Adh1 diverso da quello wildtype generando bande di taglia minore rispetto all’Adh1 del ceppo 1014.


L’attività di ricerca presentata in questo elaborato è stata condotta presso il dipartimento di Ecofisiologia Molecolare delle Piante Arboree della facoltà di Agraria La Tuscia di Viterbo e il laboratorio di Microbiologia del dipartimento di Biologia Evoluzionisitica “Leo Pardi” dell’università di Firenze.
Silvia Frucci, Matricola 251972