• random integration
• gene targeting

La terapia genica è una tecnica sperimentale utilizzata per la cura di malattie geniche ed alterazioni dell’espressione genica. Consiste nel trasferimento all’interno della cellula, contenente il gene alterato, di frammenti di DNA esogeno della copia wild type di tale gene. L’introduzione di DNA esogeno può avvenire attraverso l’utilizzo di virus ricombinanti che infettano le cellule con un alta efficienza e quindi possono trasferire il DNA all’interno della cellula. Tra i vettori virali più usati in terapia genica, quelli derivati dal virus Adeno-associato (AAV) sono sicuramente a basso rischio poichè questo virus non è patogeno e non scatena risposta immunitaria. Oltre che per iI trasferimento genico, i vettori AAV sono utilizzati anche per il gene targeting che è una metodica utilizzata per inserire mutazioni in geni specifici in quanto ha il potenziale di eliminare o correggere mutazioni negative dominanti. Con i vettori AAV sono stati ottenuti alti livelli di gene targeting, ma c’è sempre il rischio potenziale che il vettore si integri in maniera casuale nel genoma ospite. L’integrazione casuale del DNA può avere effetti negativi in quanto potrebbe comportarsi come mutageno inserzionale o attivatore di proto-oncogeni.
Il lievito Saccharomyces cerevisiae è un eucariote unicellulare utilizzato come organismo modello per studiare processi biologici in quanto è facile da manipolare e coltivare (veloce e poco costoso).
Lo scopo di questa tesi è valutare se il lievito S. cerevisiae possa essere utilizzato come sistema genetico per lo studio della integrazione omologa e non-omologa di un DNA omologo ad un gene cromosomale fiancheggiato dalle ITRs che sono le sequenze necessarie per l’integrazione e la replicazione di AAV nelle cellule umane. Per studiare l’effetto delle ITR, abbiamo costruito il plasmide pAAV-LUL contenente il gene LYS2 interrotto dal gene URA3 e fiancheggiato dalle ITRs. pAAV-LUL è stato trasformato nel ceppo di lievito RSY12 che porta la completa delezione del gene URA3. Successivamente alla trasformazione le cellule vengono fatte crescere su terreno selettivo. Nei nostri esperimenti il gene “target” è il LYS2 che viene deleto mediante l’integrazione del frammento ITR-lys2-URA3-lys2-ITR contenuto nel plasmide. Se avviene gene targeting il gene LYS2 viene deleto e viene integrato il gene URA3 con conseguente capacità di crescita in mezzo selettivo senza uracile. Gli eventi di gene targeting portano a colonie URA3+ lys2- mentre quelli di random integration a colonie Ura3+ Lys2+. I risultati indicano che la frequenza di gene targeting è circa 8 volte più alta della frequenza di integrazione non omologa. Quando il costrutto viene trasformato senza ITR, il gene targeting è circa 4 volte più alto dell’ integrazione non omologa. Questa osservazione suggerisce che le ITR favoriscono il gene targeting. L’espressione della proteina Rep68, proteina virale essenziale per la replicazione e l’integrazione del genoma di AAV, non determina nessuna variazione nel rapporto tra gene targeting e integrazione non omologa. Inoltre abbiamo effettuato un’analisi molecolare sul DNA genomico estratto dai cloni ottenuti per ”random integration” allo scopo di determinare se le ITR influenzino il numero e il sito di integrazione.
I risultati dei Southern blot confermano che le integrazioni multiple dipendono dalla quantità di DNA transformato. Inoltre, il numero di copie integrate non è influenzato dalla presenza delle ITR .
Al fine di valutare se esiste un sito di integrazione random preferenziale sono state analizzate le sequenze dei siti di integrazione random.