• expression cloning
• cellule staminali embrionali
• differenziamento dei neuroni serotoninergici

Il sistema serotoninergico è uno dei cosiddetti sistemi a proiezione diffusa: infatti i neuroni serotoninergici, che hanno i corpi cellulari a livello dei nuclei del raphe (otto nuclei distribuiti fra ponte, medulla e mesencefalo), estendono le proprie proiezioni in tutto il sistema nervoso centrale. Coerentemente con questo tipo di anatomia, la serotonina è implicata nella modulazione di numerosi processi fisiologici, quali il controllo dell’appetito, dei ritmi circadiani, del comportamento sessuale. La serotonina inoltre riveste un ruolo importante nel controllo di alcuni aspetti comportamentali ed è implicata in numerose patologie psichiatriche quali ansia, depressione, schizofrenia.
Per questo motivo, anche ai fini di un eventuale riscontro in campo medico, è importante capire quali siano i geni chiave che, durante lo sviluppo, fanno sì che determinati precursori neurali differenzino in neuroni serotoninergici. Ad oggi non è stato identificato un gene master che da solo sia in grado di guidare un precursore verso un destino serotoninergico, ma tale fenotipo è il risultato dell’interazione di più fattori genetici. Tra questi rivestono una particolare importanza i geni Pet-1, Nkx2.2 e Lmx1b. Infatti in esperimenti su topi in cui la funzione di questi geni è stata alterata (topi knockout) si è potuto vedere un mancato differenziamento dei neuroni serotoninergici o una riduzione del loro numero. Inoltre mediante esperimenti di guadagno di funzione in embrioni di pollo è stato dimostrato che l’espressione ectopica mediante elettroporazione di Lmx1b e Pet-1 nei progenitori ventrali del midollo spinale in via di sviluppo, dove è già presente l’espressione di Nkx2.2 endogeno, promuove il differenziamento di neuroni serotoninergici in posizione ectopica. Ciò non succede invece nei progenitori dorsali, dove Nkx2.2 non è espresso. L’espressione combinata di Nkx2.2, Lmx1b e Pet-1 è in grado quindi di far differenziare in neuroni serotoninergici ectopici specifiche popolazioni di neuroblasti nel midollo spinale in via di sviluppo del pollo.
Varie evidenze sperimentali suggeriscono comunque che, oltre a questi tre geni, numerosi altri fattori entrino in gioco nel differenziamento dei neuroni serotoninergici.
Un ottimo strumento per testare possibili fattori coinvolti nel differenziamento verso un particolare tipo cellulare è costituito dalle cellule staminali embrionali (ES). Queste cellule infatti, se sottoposte ad adeguati stimoli, sono in grado di differenziare verso tutti i possibili tipi cellulari caratteristici della specie cui appartengono. Tali stimoli, che di solito mimano i segnali di specifici distretti dell’embrione, sono capaci di indurre le cellule staminali in coltura ad intraprendere un destino differenziativo piuttosto che un altro.
Nel corso degli ultimi anni sono stati messi a punto numerosi protocolli sperimentali che permettono di ottenere cellule simili ai neuroblasti presenti nel tubo neurale precoce a partire da cellule staminali embrionali di topo. Per far questo, normalmente si generano corpi embrioidi (aggregati simili ad embrioni che le staminali embrionali formano se coltivate in sospensione) e successivamente si trattano le cellule con acido retinoico. A questo punto, l’espressione di fattori coinvolti nella generazione di particolari tipi neuronali può promuovere il differenziamento terminale dei neuroblasti in vitro.
Una strategia sperimentale per individuare i geni coinvolti nel differenziamento serotoninergico consiste nel cercare di ottenere, da cellule staminali di topo, neuroblasti su cui testare fattori candidati, per verificare se tali fattori siano capaci di indirizzare il differenziamento verso il destino serotoninergico.
Il mio lavoro di tesi si inserisce all’interno di un progetto di “expression cloning” che prevede la generazione in vettori di espressione di una genoteca di cDNA a partire da precursori dei neuroni serotoninergici, e la successiva espressione dei cDNA in una particolare linea di cellule staminali embrionali di topo modificate allo scopo di rendere visualizzabile un loro eventuale differenziamento in neuroni serotoninergici.
Nel laboratorio dove ho svolto l’internato, infatti, è stata recentemente generata una linea di cellule staminali embrionali di topo knockin Tph2EGFP(frt-neo-frt). Questa linea presenta, su un allele, le sequenze codificanti per il gene reporter EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) e per il gene neo (posto tra due siti frt) che conferisce resistenza all’antibiotico neomicina, in sostituzione della sequenza codificante per la triptofano idrossilasi 2 (Tph2), l’enzima che catalizza la reazione limitante nella sintesi della serotonina.
Queste cellule possono funzionare da “sensore” di differenziamento serotoninergico in quanto presentano il gene reporter EGFP sotto il controllo delle sequenze regolatorie del gene Tph2, che si attiva solo nei neuroni serotoninergici differenziati: ci si aspetta infatti che, nel caso in cui queste cellule si differenzino in neuroni serotoninergici, esse risultino verdi se osservate con microscopio a fluorescenza. Questa caratteristica le rende uno strumento utile per l’approccio di expression cloning: dall’analisi dei pool di vettori della libreria eventualmente capaci di promuovere la comparsa di fluorescenza verde sarà possibile individuare nuovi geni implicati nel differenziamento serotoninergico.
Tali cellule sono state inizialmente utilizzate per la generazione di una linea di topo knockout per la Tph2 e, per la particolare conformazione del locus ricombinante, nei topi Tph2EGFP(frt-neo-frt) ottenuti il gene EGFP è silenziato a causa di una repressione trascrizionale dovuta alla presenza del gene neo, necessario per la selezione dei cloni ricombinanti al momento della generazione della linea di cellule ES. Per attivare la fluorescenza verde nei neuroni serotoninergici differenziati, i topi Tph2EGFP(frt-neo-frt) sono stati incrociati con topi esprimenti in maniera costitutiva la ricombinasi Flp: la ricombinasi Flp infatti riconosce i siti frt e promuove l’excisione del segmento di DNA tra i due siti contenente il gene neo.
Il mio lavoro di tesi consiste nella validazione della linea cellulare Tph2EGFP(frt) come strumento da utilizzare per l’approccio di expression cloning.
La prima parte del mio lavoro è consistita nella rimozione della repressione trascrizionale sul gene reporter EGFP presente nel locus Tph2 da parte del gene neo. Per questo ho introdotto un plasmide codificante per la ricombinasi Flp mediante elettroporazione nelle staminali Tph2EGFP(frt-neo-frt), allo scopo di promuovere l’excisione della cassetta neo nelle cellule. Dopo una prima selezione dei cloni sulla base della resistenza alla puromicina conferita dal plasmide, ho estratto il DNA dai cloni resistenti ed effettuato uno screening per PCR utilizzando degli oligonucleotidi disegnati su siti fiancheggianti la cassetta neo, per verificare che fosse saltata. Per tre cloni l’esito è stato positivo; ho poi analizzato questi cloni mediante Southern blot, confermando il risultato. Ho ottenuto così dei cloni Tph2EGFP(frt).
In seguito alla rimozione della cassetta neo ho voluto verificare che tali cloni non avessero perduto la staminalità a causa dei numerosi passaggi in coltura; per questo ho valutato l’attività della fosfatasi alcalina endogena. Questo esperimento ha confermato che le cellule non avevano perso la staminalità.
Il passo successivo, in vista dell’utilizzo delle cellule Tph2EGFP(frt) negli esperimenti di expression cloning, è quello di verificare che il “sensore” funzioni come atteso, cioè che le cellule siano in grado di differenziare in neuroni serotoninergici e di esprimere la EGFP come conseguenza. Per raggiungere questo scopo le cellule staminali saranno indotte ad originare neuroblasti e successivamente spinte a differenziare terminalmente in neuroni serotoninergici. Per indurre questo differenziamento terminale farò esprimere nei neuroblasti i geni Nkx2.2, Lmx1b e Pet-1, noti per la capacità di promuovere il differenziamento in senso serotoninergico in certe popolazioni di neuroblasti in vivo.
A questo scopo ho generato tre vettori di espressione contenenti la sequenza codificante per i geni Pet-1, Lmx1b e Nkx2.2, che introdurrò per elettroporazione nei neuroblasti ottenuti dalle ES Tph2EGFP(frt).
L’accensione della fluorescenza verde in tali cellule in seguito all’espressione dei tre geni potrà confermare la validità della linea cellulare in questione come “sensore” di differenziamento serotoninergico in vitro.
Allo stato attuale sto valutando quale possa essere il metodo migliore per indurre le staminali embrionali a progredire verso neuroblasti che siano in uno stato differenziativo il più simile possibile a quello che in vivo caratterizza le cellule su cui iniziano ad agire i segnali responsabili del differenziamento in senso serotoninergico.