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Archivio digitale delle tesi discusse presso l'Università di Pisa

Tesi etd-11262008-155505


Tipo di tesi
Tesi di laurea specialistica
Autore
MACCHI, FRANCESCA
URN
etd-11262008-155505
Titolo
Generazione di un modello animale con espansione di triplette GCG nel gene ARX identificata in pazienti con sindrome di West
Dipartimento
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE E TECNOLOGIE BIOMOLECOLARI
Relatori
Relatore Prof. Pasqualetti, Massimo
Parole chiave
  • Sindrome di West
  • ricombinazione omologa
  • cellule ES
  • knock-in
  • Arx
Data inizio appello
15/12/2008
Consultabilità
Non consultabile
Data di rilascio
15/12/2048
Riassunto
Il gene Arx (Aristaless-related homeobox gene) è stato isolato nel topo e in zebrafish sulla base della sua omologia con il gene aristaless (al) di Drosophila e successivamente è stato identificato il gene ortologo nell’uomo. Il gene Arx è localizzato sul braccio corto del cromosoma X ed è costituito da cinque esoni. La proteina Arx contiene vari domini funzionali altamente conservati: un omeodominio che appartiene alla classe Prd (Paired) e che presenta un residuo di glutamina in posizione 50 che assicura la specificità di interazione dell’omeodominio con il DNA; un dominio aristaless (peptide-C), che svolge il ruolo di dominio di attivazione; un octapeptide con funzione di repressore trascrizionale e quattro tratti di polialanina, la cui funzione non è stata ancora chiarita.
Nel topo il gene Arx si esprime nei somiti, nel testicolo e nel sistema nervoso centrale in via di sviluppo. Nel del sistema nervoso Arx è espresso, a partire da stadi precoci di sviluppo, nel talamo ventrale, nel telencefalo dorsale e nelle eminenze ganglionari laterale e mediale, che daranno origine a neuroni che migreranno tangenzialmente nella corteccia cerebrale e si differenzieranno in interneuroni GABAergici. Nel cervello adulto l’espressione di Arx persiste a livello di una sottopopolazione di interneuroni GABAergici corticali. Questo suggerisce che Arx sia coinvolto nel differenziamento di specifici tipi neuronali e che possa avere un ruolo nella generazione e nel mantenimento di reti neuronali funzionali. Questa ipotesi è stata confermata in seguito alla generazione di topi knockout per Arx, nei quali si ha una diminuzione del numero di cellule in proliferazione e quindi una riduzione delle dimensioni cerebrali; inoltre in questi animali sono stati messi in evidenza difetti nella migrazione e nel differenziamento degli interneuroni GABAergici. Sfortunatamente questi animali mutanti muoiono precocemente entro il primo giorno di vita, quindi non è stato ancora chiarito quale sia il ruolo di Arx nella regolazione della funzionalità degli interneuroni GABAergici maturi.
Studi condotti sull’uomo hanno dimostrato che mutazioni a carico del gene ARX sono responsabili dell’insorgenza di gravi patologie, che presentano fenotipi apparentemente non correlati. Si possono distinguere sindromi caratterizzate dalla presenza di malformazioni, come la XLAG (X-linked lissencephaly with abnormal genitalia) o la sindrome di Proud, che sono dovute a mutazioni senso o non senso nell’omeodominio di Arx, oppure sindromi che non presentano malformazioni, causate da mutazioni senso al di fuori dell’omeodominio o dall’espansione dei tratti di polialanina, come la sindrome di Partington o la sindrome di West. Quest’ultima è la più grave forma di epilessia infantile che si manifesta nei bambini al di sotto di un anno di età ed è caratterizzata da spasmi in estensione o in flessione associati a deviazioni oculari, da ipsartimia (grave perturbazione dell’elettroencefalogramma) e conseguente arresto o ritardo dello sviluppo psicomotorio. La sindrome di West è causata dall’espansione di 7 triplette GCG, che codificano per residui di alanina, all’interno dell’esone 2 del gene ARX, nel primo tratto di polialanina della proteina. Recenti studi hanno dimostrato che espansioni di polialanina in vari fattori di trascrizione causano malattie caratterizzate da ritardo mentale e da malformazioni a carico del sistema nervoso centrale. Tuttavia, data la difficoltà ad analizzare tessuto cerebrale patologico e data la limitata disponibilità di materiale autoptico, ad oggi non è stato possibile individuare le alterazioni cellulari dovute alle espansioni di polialanina che causano le patologie riscontrate nei pazienti. Grazie a studi in vitro in cui un vettore di espressione contenente il cDNA di Arx mutato è stato trasfettato in cellule in coltura, è stato dimostrato che l’espansione di polialanina induce la formazione di aggregati nucleari e provoca un aumento della morte cellulare.
Da oltre venti anni, l’introduzione di geni nella linea germinale di topo, nota come transgenesi, ha contribuito in maniera fondamentale allo studio dell’espressione e della funzione genica. Questa tecnologia ha consentito di sostituire specifici geni presenti nel genoma di topo, con geni ortologhi umani mutati, in modo da poter ottenere topi che possono essere utilizzati come modello animale per lo studio della patologia umana.
Lo scopo del mio lavoro di tesi è quello di generare una linea knockin di topo, in cui il cDNA di ARX umano, che porta l’espansione delle 7 triplette GCG, è sostituito al gene endogeno Arx di topo, in modo da ottenere un appropriato modello animale per lo studio della sindrome di West.
A questo proposito ho inizialmente generato il vettore per la ricombinazione omologa nelle cellule ES di topo, in cui il cDNA di ARX umano mutato è fiancheggiato da sequenze omologhe al DNA genomico di topo (braccia di omologia) che consentiranno l’evento di ricombinazione omologa. Le braccia di omologia sono state ottenute tramite PCR, anziché attraverso la procedura convenzionale che prevede lo screening di una libreria genomica e il successivo subclonaggio nel vettore pBKS. La PCR è stata effettuata utilizzando una DNA polimerasi che garantisce un elevato grado di accuratezza della reazione (PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase). Inoltre la reazione è stata effettuata a partire da DNA genomico di cellule ES di topo del ceppo SV129, le stesse cellule in cui verrà effettuata la ricombinazione omologa, in modo da garantire una perfetta omologia di sequenza tra le braccia di omologia ottenute e il genoma delle cellule ES. Il braccio di omologia sinistro ha sequenza omologa alla regione di 2,9 kb che si trova subito a monte del codone di inizio della traduzione del gene Arx di topo. Il braccio di omologia destro ha sequenza omologa ad una regione di 2,5 kb che si estende dall’esone 2 all’esone 3 del gene Arx. In questo modo, in seguito all’evento di ricombinazione omologa, l’esone 1 e parte dell’esone 2 del gene Arx saranno deleti e questo assicurerà l’assenza di espressione del gene endogeno. Il vettore contiene inoltre il gene neo necessario per la selezione delle cellule ES in cui è avvenuta la ricombinazione omologa. Il vettore è stato elettroporato nelle cellule ES, che sono state poi fatte crescere in presenza di G418, che consente la sopravvivenza soltanto delle cellule che esprimono il gene per la resistenza alla neomicina. In questo modo ho isolato 302 cloni di cellule ES ricombinanti, che sono stati fatti crescere fino a raggiungere la confluenza. Successivamente sono state fatte due repliche dei cloni ES selezionati in piastre da 96 pozzetti: una replica è stata conservata a -80°C e l’altra è stata utilizzata per poter estrarre da ogni clone ES il DNA genomico totale, che è stato sottoposto a Southern blot per poter selezionare i cloni ES in cui è avvenuto un corretto evento di ricombinazione omologa. Ho effettuato il primo screening per Southern blot utilizzando una sonda radioattiva esterna al braccio destro di omologia per verificare la corretta ricombinazione all’estremità 3’: a partire dai 302 cloni sottoposti a screening, ne ho selezionati 18 in cui la ricombinazione al 3’ è avvenuta correttamente. E’ in corso un secondo screening per Southern blot in cui è stata usata una sonda esterna al braccio di omologia sinistro per verificare la corretta ricombinazione all’estremità 5’. I cloni così isolati saranno sottoposti ad un terzo screening per Southern blot utilizzando una sonda interna per escludere la possibilità che il vettore si sia integrato più volte nel genoma. I cloni ES selezionati verranno successivamente iniettati in blastocisti ottenute da femmine gestanti donatrici, che saranno reimpiantate nell’utero di madri adottive, in modo da ottenere dei topi chimerici. Infine questi ultimi saranno incrociati con animali wild-type per poter verificare la trasmissione alla linea germinale.
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