• emofilia A
• fattore viii
• HA
• rfviii

L'emofilia di tipo A è una malattia genetica ereditaria che comporta la riduzione parziale o totale dell'attività di una specifica proteina: il fattore VIII (FVIII), noto anche come fattore antiemofilico, è una proteina appartenente alla categoria dei fattori della coagulazione, un gruppo di enzimi coinvolti nel processo di coagulazione del sangue.
Questa anomalia provoca un'alterazione del processo di coagulazione che espone le persone colpite ad un maggior rischio di episodi emorragici sia interni che esterni, potenzialmente molto pericolosi se non adeguatamente trattati.
Ad oggi, il miglior modo per prevenire e trattare le emorragie è la terapia sostitutiva, basata sulla
somministrazione di FVIII ricombinante (rFVIII) ai pazienti, permettendo così una migliore gestione della malattia.
Per quanto la somministrazione di rFVIII abbia aumentato le aspettative di vita dei pazienti, rimangono alcune criticità nell’utilizzo di questi prodotti. In particolare, la somministrazione di rFVIII può risultare estremamente immunogena, oppure la proteina non riesce a mantenere la sua attività per lungo tempo.
Il presente lavoro di tesi si è concentrato sullo sviluppo di nuovi rFVIII contenenti mutazioni ritenute in grado di aumentare l’attività dei fattori e al contempo diminuirne l’immunogenicità.
In prima istanza, sono stati estratti i dati delle sequenze geniche, presenti in database, per
ricavare la sequenza genica codificante la proteina di interesse. Dopo aver ottenuto, per sintesi nucleotidica, un plasmide in grado di codificare il FVIII wild type, lo stesso è stato sottoposto ad un processo di mutagenesi sito-specifica, mediante il quale sono state inserite le mutazioni di interesse. Ogni plasmide, quindi, è stato utilizzato per trasfettare cellule HEK293F e HEK293T, affinché producessero le varie proteine rFVIII. Una volta prodotte le proteine, sono stati utilizzati, western blot, saggi E.L.I.S.A. per quantificare l'antigene e test cromogenici di attività al fine di valutare la stabilità nel mezzo di coltura dei ricombinanti e la loro attività, in relazione al FVIII wild type.