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• SMC1A
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La coesina è un complesso multiproteico dalla forma ad anello che avvolge il DNA. È costituito da 4 subunità strutturali: SMC1A, SMC3, RAD21 e STAG1/2.
La formazione e la dissociazione dell’anello di coesina sono finemente regolate nelle varie fasi del ciclo cellulare attraverso l’attività di proteine regolatrici come ESCO2, HDAC8 e i complessi NIPBL/MAU2 e PDS5/WAPL.
La coesina è nota soprattutto per la funzione di tenere uniti i cromatidi fratelli durante la divisione cellulare fino al passaggio da metafase ad anafase. A questa funzione ‘canonica’ di coesione si affiancano altre funzioni dette ‘non canoniche’: interviene nella regolazione della velocità di replicazione e nella riparazione del DNA, nell’organizzazione della cromatina e nella regolazione della trascrizione genica.
Mutazioni a carico dei geni della coesina sono associate ad un gruppo di malattie umane collettivamente note come coesinopatie.
La coesinopatia più diffusa è la Cornelia de Lange Syndrome (CdLS), determinata da mutazioni nei geni NIPBL, SMC1A, HDAC8, SMC3 e RAD21. Altre coesinopatie sono la sindrome di Roberts, dovuta a mutazioni in ESCO2, e la sindrome da rotture cromosomiche di Varsavia, associata a mutazioni nel gene DDX11 il cui prodotto è un’elicasi coinvolta nella coesione dei cromatidi fratelli.
Nella maggioranza dei casi le coesinopatie si manifestano con dismorfismi facciali, alterazioni nello sviluppo e disabilità intellettiva; il quadro in cui si inseriscono è però molto complesso tanto da rendere spesso difficile effettuare una diagnosi corretta, non solo attraverso la semplice osservazione dei segni clinici, ma anche attraverso le classiche tecniche molecolari.
A determinare questa difficoltà sono diversi elementi:
1. Mutazioni a carico di geni non appartenenti al pathway della coesina determinano un fenotipo sovrapponibile a quello delle coesinopatie e in particolare della CdLS. Tra queste patologie, dette sindromi Cornelia-like, troviamo la sindrome di Rubinstein-Taybi, la sindrome di Coffin-Siris e la sindrome KBG.
2. La grande variabilità fenotipica non sempre porta al sospetto di trovarsi davanti ad un caso di coesinopatia. Per esempio, la CAID (Chronic Atrial and Intestinal Dysrhitmia), associata a mutazioni sul gene SGO1, e la CIPO (Chronic Intestinal Pseudo-Obstruction) o sindrome di Mungan, associata a mutazioni sul gene RAD21, si manifestano con un’alterazione della motilità gastrointestinale mentre i più comuni segni delle coesinopatie sono assenti.
3. La ricerca di mutazioni nei geni noti causare coesinopatie o sindromi Cornelia-like spesso risulta infruttuosa o perché esse si trovano su geni non ancora identificati o perché sono mutazioni su geni noti che sfuggono alle tecniche di sequenziamento tradizionale.
Durante la mia esperienza di laboratorio mi sono concentrata su un nuovo approccio alla diagnosi differenziale di coesinopatie che prevede l’utilizzo del Whole Exome Sequencing (WES) per la ricerca di mutazioni che possano spiegare il fenotipo osservato quando con il sequenziamento tradizionale non emergono mutazioni nei geni noti.
Sul DNA estratto dal sangue di pazienti a cui era stata diagnosticata una coesinopatia o una sindrome Cornelia-like e che erano risultati negativi a mutazioni sui geni noti è stato eseguito il WES. L’analisi dei risultati del WES ha permesso di selezionare, tra tutte le varianti individuate, quelle che si trovavano su geni che in qualche modo potessero spiegare il quadro fenotipico. Una volta individuati i geni candidati si è proceduto alla loro amplificazione attraverso PCR e al sequenziamento con la tecnica Sanger per validare la variante osservata. Per ogni paziente è stato amplificato e sequenziato lo stesso gene anche a partire dal DNA estratto dal sangue dei genitori, laddove disponibile.
Attraverso questo approccio, ho identificato mutazioni patogenetiche a carico del gene SMC1A in 5 soggetti, tutti di sesso femminile, che sono responsabili di una nuova sindrome con un quadro clinico differente dalla CdLS. Infatti, le pazienti non hanno alterazioni degli arti ma presentano disabilità intellettiva ed epilessia resistente ai farmaci.
Le mutazioni di SMC1A associate alla CdLS sono di tipo missenso o piccole delezioni in-frame mentre nei casi che ho analizzato si tratta di mutazioni che determinano la perdita della cornice di lettura con conseguente generazione di codoni di stop prematuri e quindi sintesi di una proteina tronca. Tutte le mutazioni identificate sono de novo, quindi assenti nei genitori.
Fino ad oggi sono stati descritti appena 40 casi tutti a carico di bambine. È verosimile che nei maschi, avendo una sola copia del gene SMC1A, che mappa sul cromosoma X, tali mutazioni non siano compatibili con la vita.

Cohesin is a ring-shaped proteic complex embracing DNA composed of four subunits, SMC1A, SMC3, RAD21 and STAG1/2.
Cohesin ring formation and dissociation and its loading and unloading onto DNA during cell cycle are very finely regulated through the activity of proteins interacting with the structural subunits mentioned above among which we can find NIPBL/MAU2, ESCO2, HDAC8 and PDS5/WAPL.
Cohesin is known for keeping together sister chromatids during cell division until the metaphase to anaphase transition ensuring the correct distribution of genetic material in daughter cells. In addition to chromosome segregation, during the last years, ‘non canonical’ functions have been found. In fact, cohesin is involved in the regulation of replication speed, in the DNA repair, in the tridimensional organization of chromatin and in the regulation of genes transcription.
Mutations in cohesin pathway genes are associated to human genetic disorders called cohesinopathies.
The most frequent and known cohesinopathy is Cornelia de Lange Syndrome (CdLS) caused by mutations in NIPBL, SMC1A, HDAC8, SMC3 and RAD21 genes. Other cohesinopathies are Roberts syndrome arising from mutations in ESCO2 gene and Warsaw breakeage syndrome associated to mutations in DDX11 gene whose product is a helicase involved in sister chromatids’ cohesion.
The most common phenotypical signs of cohesinopathies are facial dysmorphisms, developmental problems and intellectual disability, but a correct diagnosis is more difficult than it seems: observation of clinical signs is often confusing and even classic molecular techniques are sometimes unable to give an answer.
This complexity relies on different factors:
1. Mutations in non cohesin-related genes are associated to a clinical context resembling that of cohesinopathies, in particular of CdLS. Among these diseases, called Cornelia-like syndromes, we find Rubinstein-Taybi syndrome, Coffin-Siris syndrome and KBG syndrome.
2. The wide phenotypical variability of cohesinopathies not always guides the observer to investigate in that direction; only recently cohesinopathies such as CAID (Chronic Atrial and Intestinal Dysrhitmia) associated to mutations in SGO1 gene and CIPO (Chronic Intestinal Pseudo-Obstruction) associated to mutations in RAD21 gene, have been discovered. The classical clinical signs of cohesinpathies are missing in these disorders while a common sign is an alteration of gastrointestinal motility.
3. Looking for mutations in genes associated to cohesinopathies or Cornelia-like syndromes through classic molecular techniques can be unsuccessful because mutations might be on not yet known genes or because they might be on a site of the known gene that escapes the sequencing technique.
During my thesis internship, I focused on a new approach to the differential diagnosis of cohesinopathies and Cornelia-like syndromes based on a new generation sequencing technique called Whole Exome Sequencing (WES). WES allows to find mutations explaining the observed phenotype when classic molecular techniques, considering only known genes, fail.
WES has been performed on the DNA I extracted from the blood of patients suspected to be affected by a cohesinopathy or a Cornelia-like syndrome but negative to mutations in known genes according to classic molecular approaches. Analyzing WES results, among all variants, I selected those mapping on genes that could explain phenotypical observations and significant from a functional point of view. To validate the variant, for each patient I amplified through PCR the selected genes and sequenced them using Sanger sequencing technique. To investigate the origin of each variant in each patient, PCR and Sanger sequencing of genes on DNA extracted from parents’ blood, if available, have been performed.
Using this approach I identified, in 5 female subjects, pathogenetic mutations in SMC1A gene associated to a new syndrome different from CdLS: these patients show intellectual disability and drug-resistant epilepsy while limbs abnormalities and developmental problems are missing.
SMC1A mutations associated to CdLS are missense or small in-frame deletions but in these cases I found frameshift mutations resulting in premature stop codons and then in truncated and potentially non-functional SMC1A protein. None of the parents analized is a carrier of the mutation observed, so all these mutations are de novo.
Up to now the 40 cases described around the world are all females; it is thought that for males, carrying only one copy of SMC1A because it is located on the X chromosome, this kind of mutations are not viable.