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Archivio digitale delle tesi discusse presso l'Università di Pisa

Tesi etd-11252007-205128


Tipo di tesi
Tesi di laurea specialistica
Autore
MALVASO, SILVIA
URN
etd-11252007-205128
Titolo
Espressione di citocromi P450 (regolati dai recettori CAR e PXR) e di enzimi antiossidanti in varie regioni cerebrali di suini di controllo e pretrattati con rifampicina.
Dipartimento
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE E TECNOLOGIE BIOMOLECOLARI
Relatori
Relatore Dott. Gervasi, PierGiovanni
Parole chiave
  • Nessuna parola chiave trovata
Data inizio appello
10/12/2007
Consultabilità
Parziale
Data di rilascio
10/12/2047
Riassunto
Il citocromo P450 (P450 o CYP) indica una superfamiglia di enzimi che giocano un ruolo molto importante nelle funzioni fisiologiche e nel metabolismo degli xenobiotici, quali farmaci ed inquinanti ambientali.
Sebbene il fegato sia l’organo principalmente coinvolto nel metabolismo e che esprime maggiormente i P450, varie isoforme sono presenti anche in organi extraepatici fra cui il cervello.
Nel sistema nervoso centrale (SNC) questi enzimi svolgono, oltre al metabolismo di farmaci psicoattivi e di alcune tossine, specifiche funzioni quali: sintesi e/o metabolismo di ormoni steroidei, mantenimento dell’omeostasi del colesterolo, controllo dei livelli dell’acido trans-retinoico e metabolismo degli acidi grassi.
Ad oggi le conoscenze dei P450 nel SNC riguardano sostanzialmente il ratto e parzialmente il topo e l’uomo, mentre niente è noto nel suino. Negli ultimi anni questa ultima specie si sta sempre più facendo strada in campo medico per l’impiego dei suoi organi, principalmente il fegato, come bioreattore in pazienti in attesa di trapianto.
Nella seguente tesi abbiamo studiato l’espressione genica e l’attività di citocromi P450 (2B22, 3A22, 3A29, 3A46) regolati rispettivamente dai recettori CAR (Costitutive Androstane Receptor) e PXR (Recettore X dei pregnani), di enzimi antiossidanti e di un P4502J, avente un ruolo prevalente nel metabolismo di endobiotici. Lo studio è stato effettuato in varie regioni cerebrali (corteccia, ippocampo, cervelletto, mesencefalo, meningi e capillari isolati dalla corteccia) di suini di controllo e pretrattati con rifampicina (RIF), un noto induttore epatico in alcuni animali sperimentali, dei P450 3A e 2B tramite i recettori CAR e PXR.
Gli esperimenti sono stati condotti in 3 suini di controllo e 3 trattati con una somministrazione giornaliera i.p. di RIF (40 mg/kg) per 4 giorni consecutivi. E’ stato prelevato il fegato, dissezionate le varie regioni cerebrali e isolati i capillari dalla corteccia frontale. Dai suddetti tessuti sono state preparate le frazioni mitocondriali, microsomiali e citosoliche. Dopodiché sono state condotte analisi per valutare l’attività enzimatica dei vari P450 e per analizzare, tramite RT-PCR, l’espressione dei relativi mRNA e quelli di CAR e PXR, usando “primers” ottenuti sulla base o delle sequenze note di suino presenti in banca dati o dedotte dalle sequenze geniche di specie affini (bovino, uomo ect).
Lo studio di attività enzimatiche microsomiali e mitocondriali, quali la benzilossichinolina-debenzilasi (BQD) e l’antraldeide ossidasi (AhOx), scelte come sensibili markers rispettivamente per P4503A e P4502B, non ha mostrato alcun effetto induttivo significativo da parte della RIF nelle aree cerebrali e di barriera analizzate, a differenza di quanto riscontrato nel fegato. Tuttavia, è stato osservato che le attività BQD erano più alte nei capillari (circa 30 volte) e nel mesencefalo (circa 7 volte) rispetto a quelle presenti nelle altre aree cerebrali studiate. Nei mitocondri, fatta eccezione per il mesencefalo, le attività BQD erano più alte (di circa 10 volte) rispetto a quelle ottenute con i microsomi delle medesime aree.
I risultati delle attività catalitiche degli enzimi ad azione antiossidante, quali il glutatione-S-transferasi, glutatione-perossidasi, glutatione-reduttasi, catalasi e superossido-dismutasi hanno dimostrato che la RIF non influenza tali attività sia a livello epatico che cerebrale.
A livello trascrizionale abbiamo evidenziato l’espressione del P4502B22 ma non del CAR in tutte le aree cerebrali analizzate mentre i trascritti dei PXR e del P4503A22 sono stati trovati esclusivamente nel mesencefalo. In nessun caso i livelli di questi trascritti venivano alterati dal trattamento con RIF. Diversamente, nel fegato i trascritti dei P450 2B e 3A venivano fortemente aumentati dal trattamento con RIF.
Per quanto riguarda il P450 2J sono stati eseguiti esperimenti di RT-PCR, usando primers specifici disegnati sulla sequenza del gene recentemente clonato nel nostro laboratorio, e analisi di Western Blotting, con anticorpi policlonali anti-P4502J2 umano. Dalle nostre analisi è emerso che il messaggero per questa isoforma è presente in tutte le aree cerebrali analizzate, mentre a livello proteico gli anticorpi hanno rilevato un forte segnale nei microsomi di fegato ed una banda meno intensa nei comparti cerebrali. In nessun caso si osservava un effetto a seguito del trattamento con rifampicina.
In conclusione i dati qui riportati dimostrano che mRNA del PXR e del P450 3A22 sono espressi solo nel mesencefalo mentre abbiamo evidenziato l’espressione del CYP2B22 ma non del CAR in tutte le aree cerebrali analizzate. Inoltre, è stato visto che le attività marker di questi P450 cerebrali sia nei mitocondri che nei microsomi sono determinabili (anche se molto più basse delle attività epatiche) e resistenti a induzione da RIF, indicando una regolazione differente da quella del fegato.
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