• analisi dei profili di restrizione
• endofita fungino
• fungo fitopatogeno di debolezza
• Hypoxylon mediterraneum
• rDNA
• Xylariaceae
• deperimento delle querce
• variabilità genetica

Il fungo Biscogniauxia mediterranea è un Ascomicete appartenente alla famiglia delle Xylariaceae. È un patogeno di debolezza ad habitus endofitico, polifago, geneticamente molto eterogeneo, che si riscontra frequentemente su piante deperienti o morte di molte specie del genere Quercus oltre che su numerose specie arbustive della macchia mediterranea. Il fungo ha un ruolo molto importante nel “deperimento delle querce”, uno dei più gravi problemi fitopatologici del ventesimo secolo, diffuso sia in Italia sia in molti Paesi mediterranei e dell’Europa centro-occidentale.
Nel presente lavoro è stata indagata la variabilità genetica intraspecifica di isolati di B. mediterranea mediante l’analisi PCR-RFLP dello spaziatore intergenico del DNA ribosomale (IGS). Nelle prove sono stati impiegati sia isolati “endofitici” provenienti da piante asintomatiche di varie essenze caratteristiche della macchia mediterranea (mirto, corbezzolo, cisto, erica, ilatro e leccio) sia isolati “monoascosporici” provenienti da periteci prodotti su piante di quercia da sughero con sintomi.
Nella prima parte delle indagini è stato necessario mettere a punto un protocollo di amplificazione dell’IGS in B. mediterranea, poiché in letteratura non esiste alcuna informazione disponibile a riguardo. Inizialmente è stato utilizzato il programma Fast 1 con i primer LR12R e CNS1. Per migliorare l’efficienza della reazione di PCR sono stati modificati diversi parametri: temperature e tempi delle varie fasi del ciclo, quantità di DNA estratto, concentrazione di Mg2+ nel buffer o impiego di una soluzione “GC-RICH”. I risultati ottenuti alla fine di questa prima parte di prove non sono stati soddisfacenti: l'IGS è stato amplificato solo in pochi isolati del patogeno, e i prodotti di PCR ottenuti risultavano quantitativamente scarsi tanto da non consentire, dopo la successiva purificazione da gel, di procedere con l’analisi RFLP.
Le indagini sono quindi proseguite amplificando una parte della regione dell’IGS di 29 isolati di B. mediterranea utilizzando i primer 28STD-LCR2. I singoli prodotti di amplificazione hanno mostrato differenze di lunghezza stimate tra le 750 e le 1250 bp in dipendenza dell’isolato saggiato.
L’analisi RFLP è stata condotta sui prodotti di PCR con 11 diverse endonucleasi di restrizione. Tra tutti gli enzimi utilizzati alcuni (Cfo I,
Dra I, Hind III, Nde II) non hanno tagliato in nessun sito l’IGS dei campioni mentre i restanti (Alu I, Eco R I, Hae III, Msp I, Rsa I, Sma I, Xho I) hanno evidenziato un’ampia presenza di polimorfismi dimostrando che, in B. mediterranea, esiste un'elevata variabilità intraspecifica. Nell’analisi dei frammenti di restrizione è stato inserito come “outgroup” Trichoderma asperellum. Per individuare le relazioni filogenetiche tra gli isolati saggiati, sulla base dei profili elettroforetici ottenuti con le endonucleasi di restrizione, è stato costruito un albero filogenetico con il metodo UPGMA, analizzando in totale 182 frammenti. I risultati suggeriscono come non esista una stretta relazione tra i cluster individuati e la matrice di provenienza dei vari isolati. Tuttavia, la somiglianza media degli isolati endofitici variava tra 0,42 e 0,96 mentre quella degli isolati monoascosporici è risultata pari a 0,74.
L’analisi PCR-RFLP dell’IGS, ha dimostrato di essere una tecnica utile per studiare la variabilità genetica di B. mediterranea e tale regione potrebbe essere utilmente impiegata anche a scopi diagnostici per una rapida identificazione del patogeno all’interno dei tessuti dell’ospite.